将转染后的细胞系在培养基中按照常规方法进行培养,使其细胞生长并表达GFP-LC3。 3.处理细胞。根据实验需要,可以加入或处理细胞以诱导自噬过程。常用的方法包括处理细胞,如饥饿、药物处理或其他刺激。 4.收集细胞。在处理后的适当时间点,使用PBS缓冲液冲洗细胞,然后使用离心机将细胞以适当的转速离心收集。 5.固定细胞
自噬双标腺病毒(mRFPGFPLC3)使用指南1404.pdf,. 自噬双标腺病毒〔mRFP-GFP-LC3〕使用指南 背景: 自噬是细胞内的一种 “自食〔Self-eating〕〞的现象,凋亡是 “自杀 〔Self-killing〕〞的现象,二者共用相同的刺激因素和调节蛋白,但 是诱发阈值和门槛不同,如何转换和协调
mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作 收到病毒后的处理 (一)、腺病毒的储存 1、腺病毒采用冰袋运输。 (1)、收到病毒液后如未融化请置于-80C冰箱,下次使用时再进行分装; (2)、如客户收到时腺病毒已融化,请直接分装后置于-80C冰箱保存;若短 期内用于实验,可分装部分于4C保存(尽量一周内用完) ...
的mRFP-GFP-LC腺病毒,mRFP用于标记及追踪LC3, GF啲减弱可指 示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体,即由于GF荧光蛋白对 酸性敏感,当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检 测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了 细胞自噬流的水平, 是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的...
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术: 无自噬时,GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中; 自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。
使用荧光显微镜观察时，选择激发波长488nm（GFP）和561nm（mRFP），发射滤片匹配相应波段；图像分析采用ImageJ软件量化红点和黄点比例，以计算自噬通量指数。该方法相比传统LC3抗体染色更具优势，能够实现活细胞实时监测，避免固定细胞导致的伪影。实验优化要点包括控制感染时间避免细胞毒性，通常不超过72小时；设置阴性对照如...
1、自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3 )使用指南背景:自噬是细胞内的一种“自食(Self-eating ) ”的现象,凋亡是“自杀(Self-killing ) ”的现象,二者共用相同的刺激因素和调节蛋白, 但是诱发阈值和门槛不同,如何转换和协调目前还不清楚.自噬是指 膜(目前来源还有争议,大部分表现为双层膜,有时多层或单层)包 裹...
实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒,mRFP用于标记及追踪 LC3,GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体, 即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感,当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光 发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。这种串联的荧光蛋白表达载体 系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平,是我们自噬研究尤其是 ...
摘要:为了简便自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,实验通过慢病毒转染技术,将RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛β细胞株(RIN-m5f),用G418对感染细胞进行筛选,激光共聚焦进行活细胞拍摄验证,得到100%表达RFP-GFP-LC3质粒的细胞株。无血清饥饿处理细胞,结果显示:饥饿组GFP/RFP荧光点比值较对照组下降,P62蛋白表达量...
pMRX-IP-GFP-LC3-RFP-LC3ΔG载体序列是一个大肠杆菌表达载体,Tac强启动子可以驱动GST促溶标签和目的基因融合表达,LacI阻碍蛋白和Laco操作子使本质粒在没有加入IPTG之前禁止表达,防止其影响细菌生长。表达后的融合蛋白可用凝血酶蛋白酶切割,再过一次GST柱子即可清除掉GST标签。 产品相册pMRX-IP-GFP-LC3-RFP-LC3ΔG...