ChIP 的一般流程是:甲醛固定细胞---收集细胞,将染色质复合物中 DNA 切割---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA 复合物相互结合---加入Protein A 或 Protein G 微珠,结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA 复合物---解交联,纯化...
酵母单杂交技术基于酵母细胞中报告基因的激活,将特定顺式作用元件(Bait DNA)构建到含报告基因的酵母表达载体上,将编码转录因子的CDS(Prey蛋白)构建到另一个含激活结构域的酵母表达载体上,将上述两种融合表达载体共转化至酵母细胞中,此时转录因子若能结合在顺式作用元件上,则会启动下游报告基因的表达。 图 酵母单杂交...
双荧光素酶报告基因实验的应用双荧光素酶报告基因实验目前由两个主要的应用方向，一是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用，转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA...
凝胶阻滞实验EMSA流程 凝胶阻滞(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)实验是体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。其原理为蛋白质与核酸分子结合后将大大增加其相对分子质量,而凝胶电泳中核酸的迁移率与其相对分子质量成正比,因此没有结合蛋白质的核酸片段跑得快,而与蛋白质结合形成复合物的核酸...
DNA-蛋白质互作是指DNA分子与蛋白质分子之间的相互作用。这种相互作用可以通过多种方式发生,包括直接结合、间接调控以及增强或抑制转录等。DNA-蛋白质互作的原理主要涉及以下几个方面: 1.DNA序列特征:DNA具有一定的序列特征,不同的序列特征可以吸引特定的蛋白质结合。例如,某些蛋白质结合特定的启动子序列,参与基因的转录...
CUT&Tag是研究蛋白和DNA互作的新兴实验方法,该方法是通过蛋白特异性抗体引导Protein A-Tn5酶在目标蛋白结合的DNA位置进行切割并且在序列两端加上测序接头,经过PCR扩增后形成可以用于高通量测序的文库,随后对文库进行测序分析从而解析与目标蛋白结合的DNA片段。
分子间互作实验的类型 根据作用的分子类型(DNA、RNA和蛋白),可以将分子间互作分为以下: ①蛋白质-蛋白质:如免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(CO-IP)、GST pull-down、Far-Western Blotting ②蛋白质-RNA:如RIP、RNA pull down ③蛋白质-DNA:如染色质免疫共沉淀技术(ChIP) ...
DNA与蛋白质相互作用的实验方案包括但不限于滤膜结合分析法、凝胶迁移滞后实验（EMSA）、DNase Ⅰ足迹法、固定DNA模板上的外切核酸酶Ⅲ足迹法、检测蛋白质—DNA复合物的氢氧自由基足迹法等。这些方法各有特点，适用于不同研究场景，能够从不同角度揭示DNA与蛋白质之间的相互作用机制。实验中，滤膜结合分析...
在生物体内，DNA-蛋白质互作主要通过各种蛋白质与DNA结合，形成复合物来实现。这些蛋白质包括转录因子、DNA修复酶、DNA结合蛋白等，它们通过特异性识别DNA序列与之结合，参与调控基因表达、DNA修复和复制等重要生命活动。实验方案的设计需要考虑以下几个关键步骤：首先，选择特定的DNA序列或片段作为研究对象，这...
然而,并非所有的蛋白-DNA互作都发生在我们通常认为的启动子区域。实际上,有些蛋白质会在基因的主体部分(即gene body)与DNA结合,从而影响RNA的合成过程。此外,转录调控不仅仅是简单的开启或关闭,它还涉及到转录起始、延伸甚至终止等多个阶段。因此,在设计实验验证某个转录因子的功能时,科学家们往往需要采用多种方法综...