通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中，实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进： MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比，SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用，进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程：向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P6...
通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中,实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进: MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比,SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用,进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程:向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HS...
通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中,实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进: MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比,SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用,进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程:向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HS...
通过将蛋白质相互作用RNA适体MS2添加到 sgRNA 中,实现了一种称为协同激活介体 (SAM) 系统的改进: MS2可招募p65AD与热休克因子1(HSF1)融合蛋白。与单独的 dCas9-VP64 相比,SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用,进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程:向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HS...
值得注意的是,在桥 RNA 中使用了单个 COM 发夹,因为 COM 蛋白与单个 COM 发夹底部的双链 RNA,和双链接头的引入可能会破坏 COM RNA 和 COM 蛋白的相互作用。使用 NUPACK 分析了所有桥 RNA 的二级结构。在设计中,在不同转录激活系统中...
与单独的 dCas9-VP64 相比,SAM 技术与 dCas9-VP64 结合使用,进一步增强了内源基因的激活效率。具体操作过程:向实验细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的表达载体,进行抗性筛选。然后使用递送sgRNA/MS2的第三种表达载体转导细胞,并用另一种抗生素进行筛选,即可达到激活或增强靶标基因表达的目的。
CRISPR SAM(synergistic activation mediator)采用切割活性缺失的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白,加上能与RNA结合蛋白MS2的sgRNA2.0,特异性识别并结合目标基因的启动子。MS2蛋白上连接p65和HSF1转录激活蛋白。通过多种转录激活蛋白的协同作用,能更好的模拟细胞内转录激活(图1,CRISPR/Cas9 SAM原理)。研究表明,单一位点SAM...
CRISPR-SAM采用无DNA切割活性的dCas9蛋白融合VP64转录激活蛋白,加上能与MS2蛋白结合的sgRNA2.0,特异性识别并结合含sgRNA靶点的启动子。MS2蛋白连接p65和HSF1转录激活蛋白(MPH融合蛋白)。通过多种转录激活蛋白的协同作用,能更好的摸底细胞内转录激活。 Hela-dCas9-VP64-MPH细胞稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MPH融合蛋...
MS2蛋白与另外的活化剂如p65和人热休克因子1(HSF1)融合,这使得每个dCas9分子可以募集13个活化分子(图2a)。这个新的dCas9-SAM系统可以可靠地将基因表达从10倍增加到几千倍(图2b)。由于这个系统需要设计修饰的sgRNA,人们开发了第三代dCas9-SAM系统,也称为dCas9-VPR系统。这个系统由VP64,p65和RTA融合而成,且不...
这项研究中,研究人员首先开发了一种较于以往更加强大的融合dCas9的激活系统(SPH,SunTag-p65-HSF1),并且分别在人和小鼠的细胞里验证了SPH系统的高效性以及特异性(下图)。 在此基础上,研究者构建了受Cre重组酶调控的SPH转基因小鼠,并且证明了在SPH小鼠的原代细胞里导入sgRNA可以激活基因和长链非编码RNA。为了确定该转...