CUT&RUN的主要步骤是首先将细胞通透化,随后加入目的蛋白抗体特异性的结合在目的蛋白处,并招募和protein A/G偶联的微球菌核酸酶(pA/G-MNase),最后加入Ca²⁺激活MNase活性,切割目标区域的DNA并回收,用于qPCR检测或NGS建库测序。 CUT&RUN实验流程: 1. 收获细胞并和beads结合: 收获细胞,并且进行细胞计数,推荐起始...
一般来讲能做ChIP或CUT&Tag的抗体可以用于CUT&RUN,特别是能做CUT&Tag的抗体基本都能用来做CUT&RUN,不过我们确实也发现过某些抗体做ChIP效果很好,但是CUT&RUN效果不太理想。首先建议使用Active Motif CUT&RUN验证抗体中列出的抗体进行CUT&RUN实验,如果没有合适的抗体可供选择,可以优先选择能做ChIP或CUT&Tag的抗体作...
首先,对于CUT&RUN实验本身,其中pA-MNase酶的加入是关键因素,在文章中,作者探究了在500µl的体系中对60万个K562细胞加入不同浓度的pA-MNase消化30分钟后,检测H3K27me3的基因组的荧光强度,结果可以看出CUT&RUN对pAG-MNase的浓度相对不敏感,其中将pA-MNase的浓度提高到约100ng/ml以上,几乎没有其他释放(图2)。...
CUT&RUN的原理为利用特异抗体结合目标靶点蛋白,随后用pA-MNase结合抗体进行靶向切割,切割后产生的片段可通过自由扩散进入溶液上清,回收后即可用于建库测序。后续pAG-MNase融合蛋白,高钙/低盐酶切条件和残留大肠杆菌DNA归一化的方法的改进,使得CUT&RUN流程进一步成熟。与传统的X-ChIP-seq相比,CUT&RUN具有多种优点:①CUT...
实验重复性好,可加入spike-in进行定量分析 没有分子断裂引发的偏差 易于实现自动化 可用于单细胞水平研究 ChIP-Seq与CUT&RUN对比 *对于转录因子,建议测序深度25M reads 实验流程 1.细胞或细胞核与磁珠结合 2.通透处理和抗体结合 3.MNase 结合和靶序列切割 ...
传统ChIP-seq流程,了解一下:https://github.com/hbctraining/Intro-to-ChIPseq/blob/master/schedule/2-day.md Cut&Run与ChIP-seq的核心区别 pA-Tn5的引入,增强了捕获的特异性,使得起始量需求变少,信噪比变低,需要的数据量变少。改善的信噪比意味着绘制染色质特征所需的 测序量减少了一个数量级 ...
最小化背景: 在目标蛋白质/DNA复合物的两端原位切割未结合的DNA序列,能够最小化免疫捕获的背景,允许进行少于1000万次读取的测序数据分析。 快速、流程简化的程序: 从细胞到文库DNA的程序不到3小时。 高度便捷: 试剂盒包含了CUT&RUN每个步骤所需的所有组分,因此EpiNext™ CUT&RUN Fast试剂盒是最方便的,能够提供...
SEACR(Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN)用于识别 CUT&Tag 数据中的峰值。SEACR 的输出文件中,第六列包含峰值区域的起始和结束位置,格式为 chr:start-end,表示该区域内信号最强的位置。为了在热图中对齐信号,我们需要计算每个峰值区域的中点。这有助于在生成热图时,使不同峰值的信号在同一位置对齐。如,...
对于ATAC-seq 数据,总是进行重复读数的移除。 在许多 CUT&RUN 分析方法中,重复reads的移除是一个可选步骤。通常默认是保留重复reads,因为 CUT&RUN 增加了生物学重复reads的可能性。更具体地说,由于染色质的核酸酶切割在其典型性质上受到染色质构象和/或核酸酶偏好的影响,增加了来自不同细胞的相同reads的可能性。
具有成本效益:与传统的CUT&RUN实验相比,每次反应的价格几乎是一半。 无需特殊软件:使用现有经过时间考验的ChIP-seq生物信息学流程来进行NGS数据分析。 保存建议: 该试剂盒分两部分运输:第一部分在室温下,第二部分在4C的冷冻冰袋上。 收到后,根据上表中的温度避光储存组件。