CUT&RUN的主要步骤是首先将细胞通透化,随后加入目的蛋白抗体特异性的结合在目的蛋白处,并招募和protein A/G偶联的微球菌核酸酶(pA/G-MNase),最后加入Ca²⁺激活MNase活性,切割目标区域的DNA并回收,用于qPCR检测或NGS建库测序。 CUT&RUN实验流程: 1. 收获细胞并和beads结合: 收获细胞,并且进行细胞计数,推荐起始...
在“Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers”这篇文献里,作者比较了CUT&RUN技术与传统CHIP技术,验证了无论在实验操作可控性,细胞数量要求,还是测序结果信噪比方面,CUT&RUN技术都要比CHIP技术有更多的优势。 首先,对于CUT&RUN实验本身,其中pA-MNase酶的加入是关键因素,在...
CUT&RUN技术检测范围更广,且提供了一种更快速、更可靠、真正的低细胞数测定法,可在一天之内完成从活细胞到纯化 DNA 的过程,且经证明每次检测只需使用少至 500-1000 个细胞 (1,2)。 CUT&RUN操作流程 抗体& pAG-MNase 结合 1. 细胞固定结...
图1.CUT&RUN实验流程图 (Skene et al., 2018)。 2019年,Steven Henikoff团队使用pA-Tn5替代pA-MNase,推出了CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)技术。其原理与CUT&RUN类似,首先通过刀豆蛋白A包被的磁珠(ConA beads)吸附细胞(与细胞膜上的糖蛋白结合),通过洋地黄皂苷在细胞膜上“打孔”,在抗体引导...
图1. EpiNext™ CUT&RUN Fast试剂盒的工作流程。 图2. 使用EpiNext™ CUT&RUN Fast试剂盒进行目标蛋白质/DNA富集: 通过控制抗体(抗H3K9me3和抗RNA聚合酶II,EpigenTek)从100,000个Jurkat细胞中捕获组蛋白/DNA复合物。非免疫IgG作为对照。富集的DNA被纯化并通过荧光定量以比较富集倍数。
简述陶瓷地砖楼面的施工工艺流程 一、准备工作阶段。 在进行陶瓷地砖楼面的施工之前,需要进行一系列准备工作。 1.确定材料和工具:首先,施工人员需要根据设计需求确定所需的陶瓷地砖、胶水、腻子等材料,并准备所需的工具,如切割机、胶刮等。 2.清理基层:接下来,需要对施工区域的基层进行清理,确保基层平整、干净,并去...
CUT&RUN的原理为利用特异抗体结合目标靶点蛋白,随后用pA-MNase结合抗体进行靶向切割,切割后产生的片段可通过自由扩散进入溶液上清,回收后即可用于建库测序。后续pAG-MNase融合蛋白,高钙/低盐酶切条件和残留大肠杆菌DNA归一化的方法的改进,使得CUT&RUN流程进一步成熟。与传统的X-ChIP-seq相比,CUT&RUN具有多种优点:①CUT...
由于技术上的困难,在新鲜细胞上使用CUT&RUN技术并不总是可行的。因此,在BMC Research Notes中,Boyd和同事研究了这种新方法如何使用冷冻细胞。Boyd及其同事比较了新鲜细胞和冷冻样品的CUT&RUN流程,并提出了一个名为ssvQC的R包,用于质量控制和来自这项技术的数据质量对比。研究人员发现,冷冻样本是对组蛋白标记(H3K4me3...
如下图所示,我们可以比较一下这几种检测染色质开放区技术的检测范围和灵敏度: 1.2 实验流程 整个实验流程可以分为6个步骤: 细胞悬液制备(500~50000个细胞,最难的一步) 细胞裂解,制备细胞核(完整性十分重要) Tn5酶切,37℃酶切孵育 DNA片段纯化,磁珠法回收 ...
图4. CUT&Tag、CUT&RUN(Henikoff于2017年发明了新技术)的peaks鉴定结果与ChIP-Seq的对比(Henikoff,2019) 同时CUT&Tag可以对极少量细胞(60个细胞)进行操作,实现单细胞测序。Protein A-Tn5在细胞内进行核酸切割,PCR之前的反应都在细胞内进行。Henikoff博士通过分配单个细胞到5184纳米孔,再加入带随机标签的引物进行扩增...