-CUT&RUN-qPCR:尽管CUT&RUN技术可能需要额外的优化步骤,但其高灵敏度和低背景噪声使得其在许多情况下成为理想的替代方案。总体上,CUT&RUN的实验成本可能较高,但在需要高分辨率数据的研究中是值得的。 -传统ChIP-qPCR:ChIP-qPCR是一种成熟的技术,通常在实验设计和优化方面更为成熟,但在某些应用场景下可能无法提供与...
CUT&RUN的主要步骤是首先将细胞通透化,随后加入目的蛋白抗体特异性的结合在目的蛋白处,并招募和protein A/G偶联的微球菌核酸酶(pA/G-MNase),最后加入Ca²⁺激活MNase活性,切割目标区域的DNA并回收,用于qPCR检测或NGS建库测序。 图1:CUT&RUN实验原理 3. CUT&RUN实验流程 那么接下来我们将详细讲解CUT&RUN的实验...
4️⃣ 回收与检测:回收切割的DNA片段,用于qPCR检测或NGS建库测序。📈 CUT&RUN与CUT&Tag的比较Henikoff实验室在2019年推出了另一种方法CUT&Tag,它适用于更少量细胞,步骤也更简单。CUT&Tag解决了极少量细胞甚至单细胞的修饰组蛋白分布分析,极大推动了单细胞水平的表观遗传学调控研究。虽然CUT&Tag有其局限性,但...
CUT&RUN文库构建实验操作演示(HD102), 视频播放量 1086、弹幕量 1、点赞数 16、投硬币枚数 3、收藏人数 16、转发人数 6, 视频作者 诺唯赞, 作者简介 离5万粉丝还有亿点点的科研搭子 官网:https://www.vazyme.com/ TEL:400-600-9335 ,相关视频:化学实验操作(合),CUT&
PART 1 CUT&RUN实验基本步骤 以CST 备受欢迎的CUT&RUN试剂盒#86652为例:首先将细胞固定在伴刀豆球蛋白A磁珠上,然后用洋地黄皂苷通透细胞膜,加入一抗和pAG-MNase(Protein A-Protein G-微球菌核酸酶),一抗募集pAG-MNase到靶蛋白上,0度条件下添加Ca2+激活pAG-MNase,并切割靶蛋白两侧的DNA,使其从基因组中释放出...
图1. CUT&RUN 操作流程图(来自#86652说明书) Cell Signaling Technology® (CST)优化后的 CUT&RUN 的操作流程如下: 抗体& pAG-MNase 结合: 1. 细胞固定结合在 Concanavalin A 包被的磁珠上,以进行后续缓冲液和试剂的交换处理。 2. 细胞膜用洋...
图1.CUT&RUN实验流程图 (Skene et al., 2018)。 2019年,Steven Henikoff团队使用pA-Tn5替代pA-MNase,推出了CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)技术,其原理与CUT&RUN类似,首先通过刀豆蛋白A包被的磁珠(ConA beads)吸附细胞(与细胞膜上的糖蛋白结合),通过洋地黄皂苷在细胞膜上“打孔”,在抗体引导...
»重复性好:实验重复结果一致性好。 Henikoff等通过三种方法来对组蛋白H3K27me3进行研究,在相同的数据量(8M Reads)情况下,三种方法的染色体景观相似,但ChIP-Seq的背景较高,CUT&Tag的信号更强,信噪比更高。 图4. CUT&Tag、CUT&RUN(Henikoff于2017年发明了新技术)的peaks鉴定结果与ChIP-Seq的对比(Henikoff,2019...
1.2 实验流程 整个实验流程可以分为6个步骤: 细胞悬液制备(500~50000个细胞,最难的一步) 细胞裂解,制备细胞核(完整性十分重要) Tn5酶切,37℃酶切孵育 DNA片段纯化,磁珠法回收 PCR扩增12-15个循环 上机测序 上面PCR扩增这一步的流程,可以看到Tn5酶切过程中会在上下游分别产生一个缺口,因此需要72℃延伸的过程...
图1.ChIC/CUT&RUN 实验方案示意图。细胞核附着在磁性伴刀豆球蛋白 A 磁珠上,以便进行细胞处理并在每次洗涤后安全除去液体。对细胞核进行通透处理,同时与靶向目标蛋白的抗体一起孵育。pAG-MNase (☞ab285373) 融合蛋白与靶向目标蛋白的抗体结合。...