EpiCypher还检测了阳性对照和实验靶标高于IgG阴性对照反应的产量(即使只是略高)。根据概述的指标确认好DNA质量后,即可进行下一步的文库构建。 步骤7:CUT&RUN文库构建 将修复纯化的CUT&RUN DNA连接到测序adapter上,并进行PCR扩增以生成测序文库。PCR扩增使用了针对CUT&RUN低产量和小片段规格的优化参数,条形码引物用于实...
CUT&RUN的主要步骤是首先将细胞通透化,随后加入目的蛋白抗体特异性的结合在目的蛋白处,并招募和protein A/G偶联的微球菌核酸酶(pA/G-MNase),最后加入Ca²⁺激活MNase活性,切割目标区域的DNA并回收,用于qPCR检测或NGS建库测序。 图1:CUT&RUN实验原理 3. CUT&RUN实验流程 那么接下来我们将详细讲解CUT&RUN的实验...
CUT&RUN的原理与ChIP相似,适用于研究组蛋白修饰、转录因子、染色质修饰酶以及其他DNA结合蛋白在基因组上的结合位点。关键区别在于,CUT&RUN通过抗体靶向和核酸酶原位切割,将目的蛋白结合的DNA从染色质上切割并释放出来。其主要步骤包括:1️⃣ 细胞通透化:首先将细胞通透化,以便抗体能够进入细胞内部。 2️⃣ 抗体...
CUT&RUN文库构建实验操作演示(HD102), 视频播放量 1086、弹幕量 1、点赞数 16、投硬币枚数 3、收藏人数 16、转发人数 6, 视频作者 诺唯赞, 作者简介 离5万粉丝还有亿点点的科研搭子 官网:https://www.vazyme.com/ TEL:400-600-9335 ,相关视频:化学实验操作(合),CUT&
对照和标准化是整个实验的关键步骤。阳性对照推荐使用H3K4me3或者H3K27me3,;阴性对照推荐使用Rabbit IgG。你还可以使用spike-in来进行标准化。 CUT&RUN有6种主要试剂。这里需要注意的是,根据你的实验材料是细胞、nuclei、或者固定的细胞,所使用的试剂是不一样的(这里试剂列表就不贴了,有需要的同学可以去试剂盒官网...
图1.CUT&RUN实验流程图 (Skene et al., 2018)。 2019年,Steven Henikoff团队使用pA-Tn5替代pA-MNase,推出了CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)技术,其原理与CUT&RUN类似,首先通过刀豆蛋白A包被的磁珠(ConA beads)吸...
CUT&RUN、CUT&TAG是近些年提出的两个更高效的实验设计。 image from ENCODE 1、ChIP-seq(Chromatin Immuno-Precipitation) 染色体免疫共沉淀反应 1.1 上游实验原理 A 实验步骤 参考下图,主要分为5步 (1)甲醛交联 (2)超声打断 将所有DNA打断成一定长度的小片段; ...
图1.ChIC/CUT&RUN 实验方案示意图。细胞核附着在磁性伴刀豆球蛋白 A 磁珠上,以便进行细胞处理并在每次洗涤后安全除去液体。对细胞核进行通透处理,同时与靶向目标蛋白的抗体一起孵育。pAG-MNase (☞ab285373) 融合蛋白与靶向目标蛋白的抗体结合。...
尽管后来出现的定向切割和核酸酶释放(CUT&RUN)技术解决了部分问题,但是CUT&RUN技术是在未固定的完整细胞或核上原位进行的,需要通过蛋白AG-微球菌核酸酶(pAG-MNase)融合蛋白在特定抗体占据的位点切割染色质,并随后释放蛋白/DNA复合物,使用的pAG-MNase融合蛋白可能会产生由未偶联抗体的pAG-MNase引起的非特异性切割,这...