1.CRISPRi和RNAi的区别 答:CRISPRi在转录水平上抑制基因表达,通过阻断转录起始实现沉默;RNAi则通过降解mRNA来抑制基因表达。 2.CRISPRi技术中gRNA设计原则 答:为了调节基因调控,gRNA 通常被设计为靶向启动子区域和转录起始位点 (TSS) (+1) 3.CRISPRi的局限性有哪些? 答:PAM序列的存在限制了可靶向的基因位点数量...
CRISPRi (基因抑制/沉默)系统是用于抑制内源性基因转录的强大工具,当dCas9(没有切割活性的Cas9)被引导到靶基因的转录起始位点TSS(transcription start site)时,dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶的通过,导致基因沉默。同时dCas9融合了一个基因抑制结构域,如KRAB结构域,这样的蛋白称之为dCas9-KRAB,可以进一步提高转录抑制...
1. 将hiPSC衍生的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞整合到iAssembloids中 为了构建一个可用于基于CRISPRi基因筛选方法的、可扩展的三维神经元-星形胶质细胞-小胶质细胞共培养系统，作者挑选了针对hiPSC衍生的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞的分化方案。在构建iAssembloids时，将分化后的星形胶质细胞与未成熟的分化神经...
我院孙东昌教授课题组致力于CRISPR系统的基础与应用研究,前期发现核结合蛋白StpA调控大肠杆菌I型CRISPR系统的新机制(Sun et al., Appl Environ Microbiol, 2022)。近期,通过将来自大肠杆菌的I型CRISPR系统整合至枯草芽孢杆菌中,结合转录和翻...
CRISPRi 技术通过利用失活的 Cas 蛋白(如 dCas9)与 sgRNA 结合,在不切割 DNA 的情况下,特异性地结合到目标基因的启动子或其他调控区域,从而抑制基因的转录。在靶向 TNFR1 时,首先需要设计针对 TNFR1 基因启动子或其他关键调控区域的 sgRNA。 通过将编码 dCas9 和 sgRNA 的载体导入细胞中,dCas9 - sgRNA 复合...
CRISPRi 技术原理:CRISPR 干扰(CRISPRi)是一种基于 CRISPR - Cas 系统的基因表达调控技术。它不依赖于核酸酶对 DNA 的切割,而是通过将失活的 Cas 蛋白(dCas)与转录抑制因子融合,使其在 gRNA 的引导下结合到目标基因的启动子或转录起始位点附近,从而阻碍 RNA 聚合酶与 DNA 的结合,抑制基因转录,实现对基因表达...
CRISPRi技术基于一个没有核酸酶活性的dCas9蛋白，即通过将RuvC和NHN两个核酸酶结构域分别导入氨基酸突变D10A和H840A，使得Cas9蛋白失去切割DNA活性，但仍保留结合DNA的能力（Dead Cas9）。图1. dCas9结构域 当dCas9被引导到某个基因的转录起始位点TSS（transcription start site）时，dCas9能够物理性阻碍RNA聚合酶...
CiBER-seq技术,就是将CRISPRi和报告基因的标签化进行结合。具体来讲,转染的质粒中,每一个标签条形码和一个gRNA、报告基因相对应,通过条形码将gRNA和报告基因的表达水平连接起来。当然条形码RNA的表达可能受到细胞数量或细胞活性的影响,选取一个管家基因启动子所...
CRISPRi-FlowFISH结合了CRISPRi(一种基因干扰技术)和FISH(荧光原位杂交技术,一种基因染色技术),通过干扰目标基因附近的候选增强子核苷酸序列,并量化这些序列对目标基因的影响。其主要原理是gRNA可以引导KRAB-dCas9与特定核苷酸序列结合,抑制该序列表达。KRAB-dCas9已经被证明可以抑制许多启动子和增强子,并影响gRNA附近的200...
本研究提出一种新的实验方法CRISPRi-FlowFISH用于量化增强子对基因的影响,并提出一个名为ABC(Activity-by-contact model)的模型用于预测增强子-基因之间的相互作用。 1 研究背景 人类基因组中的增强子可以控制基因在特定细胞类型中的表达。因此,增强子的遗传变异会导致许多常见疾病。但是,哪些增强子调节哪些特定基因,这个...