9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白;10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成);11、设计好的引物送引物公司设计合成。注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有...
9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候...
10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。 三、sgRNA质...
9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候...
11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候选靶点的序列、位置、正负链、GC含量、潜在的脱靶位点。 三、sgRNA质粒的构建方法 1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切...
11. 扩大培养,提取细胞全基因组DNA和细胞总蛋白 12. 测序 Guide序列上游100bp左右和下游200bp左右为上下游设计一对引物,以全基因组为模板,以上述引物进行PCR。PCR产物送测序,或将产物用T7E1进行酶切消化检测突变。 13. Western 与阴性对照相比,靶基因应完全敲除...
②DNA水平验证:依据设计的sgRNA序列,定位到该序列在基因组中的具体位置。选择该位置上下游约300bp范围,设计PCR引物。通过用枪头挑选细胞,进行PCR扩增,然后进行琼脂糖凝胶电泳,切取目标条带后进行回收。接着,进行TA克隆,并将克隆产物送至测序公司进行测序。通过序列比对,可以确认基因是否成功被敲除。
分子检测合集(11):QPCR 第七节 QPCR引物设计原则和方法 讴睿生物 452 0 超慢跑|180BPM 50分鐘|(只有節拍器)| wall2018 3.6万 10 第6讲 qpcr引物设计 染色的染坊 2258 0 地球上“最像龙”的10大生物 地球最TOP 59.0万 282 第3讲 氨基酸序列同源性比对 染色的染坊 1.0万 1 333分钟,一口气看完,...
以NCBI(UCSC, Ensemble等都可以)基因组DNA序列为模板设计引物,引物位于sgRNA target 位置上下游各200-300左右。以提取的gDNA为模板,PCR扩增, 得到400-600左右的PCR产物。凝胶电泳检测PCR产物特异性。若PCR产物为单一条带,送去sanger 测序,测序引物即为PCR引物。若出现杂带,则重新设计特异性强的引物,或者提高退火...
1. 引物设计 F1/R1验证5'arm打靶是否正确,F2/R2验证3'arm打靶是否正确,F5/R5、F6/R6验证两端loxP位点。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。 2. 预期片段大小 条带1的大小为:F1/R1扩增的5'arm端,包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域; 条带2的大小为:F2/R2扩增的3'arm端,包括野生型骨架...