9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列，选择正确的物种和Cas9蛋白；10、网站生成的sgRNA序列信息如下，包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息（建议sgRNA设计3-4条，利于高效完成）；11、设计好的引物送引物公司设计合成。注意：sgRNA的设计严格按照设计原则进行，需考虑所有...
9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候...
9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候...
9、输入上述已选中的同源区域的碱基序列,选择正确的物种和Cas9蛋白; 10、网站生成的sgRNA序列信息如下,包括sgRNA序列、PAM、此网站提供的特异性评分、切割效率评分、以及潜在的脱靶具体信息(建议sgRNA设计3-4条,利于高效完成); 11、设计好的引物送引物公司设计合成。 注意:sgRNA的设计严格按照设计原则进行,需考虑所有候...
CRISPR/Cas9实验流程 1.sgRNA设计 1.1设计原则 1） II型CRISPR系统（SpCas 9）的sgRNA 靶点一般为20nt 2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)3）sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量为30%-70% 4）sgRNA的序列与On-target和Off-...
1、质粒构建:构建好含有CRISPR-Cas9系统的质粒,其中包括lentiCRISPR-sgRNA。该质粒携带sgRNA序列,可指导Cas9蛋白准确识别并切割目标基因(之前已详细描述过)。 2、慢病毒包装质粒:准备慢病毒包装质粒,其中包括pCMV-VSV-G(携带包膜蛋白)和pCMV-dR8.2 dvpr(携带包装蛋白)。这两者协同作用,使得慢病毒能够高效地传递CRISPR...
1. 引物设计 F1/R1验证5'arm打靶是否正确,F2/R2验证3'arm打靶是否正确,F5/R5、F6/R6验证两端loxP位点。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。 2. 预期片段大小 条带1的大小为:F1/R1扩增的5'arm端,包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域; ...
1. 引物设计 F1/R1验证5'arm打靶是否正确,F2/R2验证3'arm打靶是否正确,F5/R5、F6/R6验证两端loxP位点。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。 2. 预期片段大小 条带1的大小为:F1/R1扩增的5'arm端,包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域; ...
步骤一:设计引物 在进行CRISPRCas9基因合成之前,首先需要设计合适的引物。引物应包括靶标基因的DNA序列和与Cas9蛋白相结合的序列。引物的设计可以借助各种基因编辑工具,如基因编辑软件和在线工具。 步骤二:引物合成和靶向序列放大 根据设计的引物序列,可以选择商业实验室或合成生物学公司进行引物合成。合成的引物可以通过PCR...
（11）通过设计引物，进行PCR，检测基因是否敲除 （12）为进一步验证，将PCR产物送去Sanger测序 6. 将敲入正确的多个单克隆进行扩增并冻存 需要注意的是尽可能多留几株不同的单克隆，以免某些单克隆的细胞特征与WT细胞差异过大。（一般文章中会使用3个不同的单克隆）本期内容针对CRISPR-Cas9基因敲入系统（knock in...