PAM序列在CRISPR-Cas9的作用是非常重要的,它可以帮助Cas9核酸酶识别和切割目标DNA序列。PAM序列有以下几个功能: PAM序列可以区分细菌自身DNA和外来DNA,防止CRISPR-Cas9系统切割错误的DNA。因为细菌自身的CRISPR基因座中没有PAM序列,而外来的病毒或质粒DNA中有PAM序列,所以Cas9只会靶向含有PAM序列的DNA。 PAM序列可以触发...
当噬菌体等外源 DNA 入侵时，CAS1/2 复合体通常识别 3' 端含 NGG 的前间隔序列邻近基序 （PAM） 区域。然后，前间隔序列 （Protospacer） 被剪切下来，作为间隔序列插入宿主 CRISPR 位点中，由重复序列隔开。PAM 序列结构简单，几乎可在所有基因中找到，因此得到广泛的应用。第二步： crRNA 合成 图 3. CRISPR/...
crRNA或crRNA-tracrRNA会和Cas蛋白形成复合体，复合体以crRNA上的spacer序列为引导，将和spacer序列互补的靶序列切割[5]。图2. 细菌CRISPR自然侵染系统[5]除此之外，绝大多数CRISPR系统的靶向性还有一定的限制，那就是PAM序列 （Protospacer Adjacent Motif，原间隔相邻序列），只有Cas酶与PAM结合后，其核酸酶活性才能...
机制研究还表明，靶向序列3’端的PAM序列对最初的DNA结合至关重要；如果没有PAM，即使与sgRNA序列完全互补的靶序列也不会被Cas9识别。当序列完全匹配时，Cas9便发挥其核酸酶活性。HNH结构域和RuvC结构域分别切割一条DNA链，从而形成DNA双链断裂（图3A）。而对这两个结构域的其中一个进行突变，便可以获得只能切割单...
Cas9的功能依赖于与之配对的gRNA,这种RNA包含了一个与目标DNA序列互补的区域,使得Cas9能够精确地识别和结合到特定的DNA序列。一旦识别并结合到目标DNA,Cas9会在特定位置(通常是在所谓的PAM序列附近)进行双链切割。 图. 不同亚型的Cas9同源酶的结构域 [2]...
富含精氨酸的桥螺旋与目标序列结合后启动裂解活性。与PAM的相互作用赋予PAM特异性,这是负责与目标序列结合。HNH和RuvC是用于切割靶序列的核酸酶结构域。由于gRNA的缺失,Cas9蛋白仍然没有活性。B程序化的gRNA与Cas9结合并使蛋白发生变化,从而使无活性的Cas9蛋白变成有...
Cpf1蛋白负责切割DNA,而crRNA的序列则用于引导Cpf1定位到目标基因组位点。与Cas9不同,Cpf1具有一些独特的特征和优势。首先,Cpf1识别目标序列时不需要依赖辅助分子(如tracrRNA),因此设计和构建crRNA相对简单。其次,Cpf1切割DNA的方式也不同于Cas9。Cpf1产生的切割位点具有突出的5'末端保护簇(PAM),这意味着Cpf1可以...
WED结构域识别sgRNA骨架,不同来源的Cas9的WED差异大,同时它与PAM序列的骨架也有相互作用。螺旋REC部分不同的Cas9差异较大,它包含负责识别gRNA和靶标DNA杂合体的区域,同时也特异性识别sgRNA的骨架。另外,生化实验和结构研究也表明,Cas9作用于DNA并切割的过程中,Cas9的构象会发生一系列的变化。