解码Cas蛋白PAM序列的生物信息学方法基于提取细菌CRISPR基因座中存在的间隔区序列(使用例如CRISPR Finder),并在Blast或其他工具(例如CRISPR Target)的帮助下在噬菌体序列数据库中找到匹配的间隔区序列[2]。通过比对原间隔区序列和分析DNA靶标侧翼序列进行评分从而筛选PAM。但这种方法存在一定的缺陷:该方法需要已知的间隔区...
一、CRISPR/Cas系统简介 CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌保护自身免受外来遗传物质影响的适应性免疫系统，该系统发挥功能包括三个阶段：第一阶段是适应，细菌通过特定Cas蛋白从入侵的核酸中识别PAM位点（原间隔序列相邻序列）并将原间隔序列整合到细菌自身的CRISPR序列中；第二阶段是表达和成熟，CRISPR转录为pre-crRNA（RNA...
crRNA或crRNA-tracrRNA会和Cas蛋白形成复合体，复合体以crRNA上的spacer序列为引导，将和spacer序列互补的靶序列切割[5]。图2. 细菌CRISPR自然侵染系统[5]除此之外，绝大多数CRISPR系统的靶向性还有一定的限制，那就是PAM序列 （Protospacer Adjacent Motif，原间隔相邻序列），只有Cas酶与PAM结合后，其核酸酶活性才能...
1. PAM序列的识别 在CRISPR - Cas9系统识别靶DNA序列的过程中，PAM（Protospacer - Adjacent Motif）序列起着关键作用。PAM序列是位于靶DNA序列附近的一段短的特定序列，不同类型的Cas9蛋白识别不同的PAM序列。例如，最常用的来自酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的Cas9蛋白识别的PAM序列是NGG（N可以是任何一种核...
CRISPR基因座:主要由前导区(leader)、重复序列区(repeat)和间隔区(spacer)构成。 Cas基因:位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方,编码的蛋白包括Cas1-Cas10。 (2)编辑原理:向导RNA能与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对结合在一起,引导Cas9...
a. CRISPR-Cas12a系统拓展了CRISPR-Cas9系统不可用的编辑位点，且能在序列5’端产生交错切割。这相比CRISPR-Cas9系统，显著增加了细胞选用同源重组修复（HDR）方式的概率，提升了基因编辑效率。b. Cas12a识别富含胸苷的PAM 序列，能够在具有丰富AT基因组的生物体中进行基因组编辑，比CRISPR-Cas9系统更具广泛的序列编辑...
CRISPR-Cas系统的分类存在于不同种类的细菌和古细菌,它们的组成和作用机制不同。第1类CRISPR-Cas系统包含多蛋白效应复合物,第2类系统只有一个效应蛋白; CRISPR-Cas系统依赖于CRISPR RNA (crRNA),向导RNA (gRNA)指导和目标特异性杂交(图1),定位到PAM或PFS序列...
Cas13a只需要24个碱基的crRNA,它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用,并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样,Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配,不过若存在2个错配,那切割效率就大大降低。它的PFS序列(相当于PAM序列)位于间隔区的3’端,由A、U 或C碱基组成。
CRISPR是“成簇规律间隔短回文重复序列”(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)的缩写,原核生物(细菌和古生菌)利用它来防止噬菌体病毒的感染。其原理核心是使原核生物能够识别与噬菌体或其他入侵者相匹配的基因序列,并利用专门的酶将这些序列作为破坏目标,这些专门的酶称为CRISPR相关蛋白Cas(CRISPR...
图B.Cas12a RNP形成的R回路示意图。R环的形成方向用虚线箭头表示。DNA中RuvC的大致切割位置用深蓝色三角形表示,但两条链都是被一个催化位点切割的。 Cas12a蛋白结合PAM直接导致PAM下游靶序列DNA的局部熔化。这可以让下游序列与crRNA寻求互补。 crRNA碱基与DNA靶链配对,进一步融合DNA,将异源双链体延伸至PAM远端...