提取部分单克隆细胞株蛋白,利用特异性抗体进行WB检测目的蛋白是否表达,通过结果分析敲除效果。若抗体特异性好(条带单一)还可以简化为Dot blot,同时快速检测多个单克隆细胞株的敲除情况。 图4. Dot blot结果示意图 汉恒专营工具病毒十余载,可提供CRISPR/Cas9相关质粒、病毒工具以及敲除细胞株构建服务,如有技术问题或产...
然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-Onelentivector中(图1) 图1 sgRNA-Cas9载体图谱 3、构建sgRNA-Cas9稳转株 利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株,进行嘌呤筛选 4、 筛细胞克隆并进行qPCR验证 嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。提取基因组DNA并进行验证测定目的基因座是否进行编辑...
2、构建sgRNA-Cas9载体 然后将选择的sgRNA设计克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-Onelentivector中(图1) 图1 sgRNA-Cas9载体图谱 3、构建sgRNA-Cas9稳转株 利用慢病毒包装体系构建sgRNA-Cas9稳转株,进行嘌呤筛选 4、 筛细胞克隆并进行qPCR验证 嘌呤霉素筛选后分离细胞克隆。提取基因组DNA并进行验证测...
将sgRNA1多克隆细胞进行单克隆铺板,扩增后的单克隆收集基因组通过PCR获得目的基因片段,进行测序发现克隆1/2分别有单个碱基和多个碱基的缺失突变,靶基因敲除单克隆细胞株构建成功。 (四)东岭CRISPR/CAS9相关载体、病毒和工具细胞 东岭团队经过长期积累,已改造获得多种CRISPR/CAS9及sgRNA相关载体用于敲除和敲入,以及spCAS9...
对于转导gRNA和Cas蛋白的常见方法主要有四种:(1)RNP法:直接将大量的gRNA和Cas9蛋白,通过电转的方式转染目的细胞(2)病毒法:构建慢病毒(LV)敲除质粒,经病毒包装和纯化后转染细胞,将sgRNA和Cas9蛋白元件整合到细胞基因组中,从而使细胞源源不断地生产sgRNA和Cas9蛋白。(3)常规质粒法:构建常规敲除质粒,通过...
5. 功能丰富:可实现敲除、插入、抑制、激活等多种目的基因. 五、CRISPR-Cas9基因编辑服务步骤 1. 靶基因分析; 2. sgRNA位点设计与筛选; 3. 载体构建; 4.转染目标细胞系; 5. qPCR方法检测载体活性; 6.病毒包装. 六、服务项目周期 编号 项目内容
2.RNP复合物在sgRNA的引导下,定位到基因组上的靶位点 3.Cas9蛋白对靶位点的DNA双链进行切割,产生双链断裂(DSB) 4.DSB引起细胞的紧急修复机制:非同源末端连接(NHEJ)修复或者同源重组修复(HDR) 5.绝大多数情况下(>80%),细胞采用NHEJ修复路径,使得靶位点位置随机产生个别碱基的删除或插入(Indel),得到基因敲除模型...
您也可以把您研究中用到的细胞系给我们,由我们为您构建Cas9蛋白表达细胞系。 产品特点 * 适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验 * 基因敲除效率比直接质粒转染更高 * pGR载体上携带荧光标签和抗性基因,更易筛选到基因敲除成功细胞 简要工作流程 包装Cas9过表达慢病毒→筛选Cas9表达细胞株→转入gRNA进行...
CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录(4)构建sgRNA+Cas9载体 image.png golden gate构建好载体,酶切验证成功 293FT细胞转染验证 (1)sgRNA+pSpCas9载体用lipofectamine 3000转染至293FT细胞(按照转染试剂的说明书走),确保转染效率> 70%; (2)72 h后收集细胞提取基因组DNA(按照基因组DNA提取试剂盒的说明书操作); ...
哺乳动物细胞Cas9基因编辑服务采用质粒转染法转入Cas9蛋白/sgRNA表达质粒和重组修复模板,通过抗性基因筛选出阳性细胞。我们有着丰富的细胞株构建经验,可为您提供基因编辑多克隆株、单克隆株筛选服务。现在可提供的服务项目包括实验方案设计、基因敲除载体构建、基因敲入、基因敲除、定点突变等。