⑪ 接下来就可以根据文库的大小,扩培需要的 Cas9 细胞量。 *注意:Cas9 稳转株构建好后,建议使用之前验证过的 sgRNA 进行编辑效率测试,编辑效率直接决定后续筛选的效果。 5. sgRNA 文库病毒包装 所需材料: 293T 包装细胞 (建议代次< 15 代) 转染质粒: CRISPR library 质粒, psPAX(包装质粒 Addgeneplasmid#12...
CRISPR-Cas9体系实验流程 (2)一、材料试剂准备 1)质粒: pSpCas9(BB)-2A-GFP(Addgene plasmid ID: 48138),用于转染cas9,该质粒含有Cas9与GFP,Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko,GFP可做为转染标签。 pSpCas9(BB)(Addgene plasmid ID: 42230),若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物,则需要该质粒做为U6的模版...
⑪ 接下来就可以根据文库的大小,扩培需要的 Cas9 细胞量。 *注意:Cas9 稳转株构建好后,建议使用之前验证过的 sgRNA 进行编辑效率测试,编辑效率直接决定后续筛选的效果。 5. sgRNA 文库病毒包装 所需材料: 293T 包装细胞 (建议代次< 15 代) 转染质粒: CRISPR library 质粒, psPAX(包装质粒 Addgeneplasmid#12...
将具有活性的Cas9和sgRNA直接转入细胞中,适合转染难度大的细胞,但是后续的筛选需要另外设计。 注意:插入不代表一定是过表达,插入破坏启动子可造成敲低或者敲减,因此有一个专业名词为indel (insertion/deletion) 实验方案正文--cloning sgRNA into pSpCas9 plasmid ~ 3 Days 在这里我直接选择将sgRNA整合到pSpCas9质粒中...
2、重组lenti-CRISPR构建和基因编辑效果鉴定被改造的慢病毒载体是pLentiCRISPR(AddgeneplasmidID:52961),该载体含有一个U6启动子用来控制sgRNA的表达,同时还含有一个EFs启动子用来控制hCas9的表达。a、化学合成寡核苷酸链,根据CRISPR-Cas9识别靶位点的原理,设计如下靶序列合成引物,格式如下(源于Addgene数据库):反义链:...
I.技术与方法1.基因调控元件的构建通过分别转染质粒pcDNA-dCas9-HA(Plasmid#61355,Addgene)和质粒M-SPn-VP64(Plasmid#48674,Addgene),令HEK293T细胞瞬时表达失活Cas9蛋白或Cas9-VP64融合蛋白。sgRNA质粒的构建过程:设计相关cDNA,合成后插入到质粒pGPU6/GFP/Neo的BamHI/BbsI位点。pcDNA3-MS2的构建过程:将MS2...
The Cas9 expression plasmid (Plasmid #44758, Addgene, Cambridge, MA, USA, obtained from Professor Xingxu Huang) was linearized with Age I and used as the template for in vitro transcription using the T7 Ultra Kit (Ambion, AM1345). Transcribed Cas9 mRNA and gRNA were both purified by ...
Synthesized double-stranded oligonucleotides were inserted into pSpCas9(BB)-2A-Puro (Addgene plasmid 48139: PX459), in accordance with the protocol published by Ran et al.11. The following oli- gonucleotides were used: exon 2, 5′-caccgagatgtcagcgagaaggccg-3′and 5′-aaaccggcct...
【crispr/cas9】构建步骤 一、材料试剂准备 1)质粒: pSpCas9(BB)-2A-GFP(AddgeneplasmidID:48138),用于转染cas9,该质 粒含有Cas9与GFP,Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko,GFP可 做为转染标签。 pSpCas9(BB)(AddgeneplasmidID:42230),若实验用sgRNA为PCR扩增纯 化产物,则需要该质粒做为U6的模版。 pUC19...
Plasmid Gene/Insert Promoter Selectable Marker PI Publication pBUN6A11 dCas9-VP64 (Synthetic), gRNA scaffold (Synthetic) Ubi1p, OsU3p Bar Chen A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 2014 Nov 29;14(1):327. Add to Cart pHSN6A01 dCas9-VP64 (Synth...