如上图所示,让Cas9切割位置(确定的)跨过一个酶切位点(比如sfcI)(在前两篇文章中都有所提及)。这样,在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候,酶切位点一定会遭到破坏。这为后续的单克隆鉴定提供了便利。 实验流程和鉴定结果如上图所示,然而,需要...
http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/3、http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html4、...
1.1 登陆http://www.rgenome.net/cas-offinder/网站,输入靶点序列,自动预测易脱靶位点。 1.2 本次参数:SpCas9 from Streptococcus pyogenes: 5'-NGG-3';Sus scrofa (susScr11) - Pig;Mismatch Number 4;DNA Bulge Size 2;RNA Bulge Size 2。 数据筛选与整理 2.1 下载数据后使用excel工具打开并进行筛选,筛...
sgRNA设计示范 1、NCBI获取基因信息,选择编辑区域 2、设计、选择sgRNA FrCas9介绍 选择舒桐科技的优势 关于舒桐 CRISPR/Cas9是细菌和古生菌的一种抵御外来核酸物质入侵的防御系统,现被开发用来作为一种对特定靶序列进行基因编辑的技术。CRISPR/Cas9系统包含2个组件,一个是Cas蛋白,一个是sgRNA。sgRNA由crRNA和tracrRNA...
一、寻找目的基因的靶标 使用在线设计网站 CRISPR direct,如需直接复制网址,可在生物学霸后台对话框回复direct即可。 靶点挑选要点: 基因敲除靶点应设计在起始密码子附近(包括起始密码子)或者起始密码子下游的外显子范围内。 不同Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上...
一、寻找目的基因的靶标 使用在线设计网站 CRISPR direct,如需直接复制网址,可在生物学霸后台对话框回复direct即可。 靶点挑选要点: 基因敲除靶点应设计在起始密码子附近(包括起始密码子)或者起始密码子下游的外显子范围内。 不同Cas9/gRNA 靶点在基因敲除效率上有较大差异,因此同时设计构建 2～3 个靶点的基因敲除载...
一、gRNA设计网站: 设计gRNA无疑需求最大,用的最多,网站也非常多,大家根据自己需求找到合适的就行,差别不大。 Cas9、Cas12的gRNA设计网站 1. https://zlab.bio/guide-design-resources 2. Cas-Designer: http://www.rgenome.net/cas-designer/
CRISPR-Cas9作为新一代的基因编辑技术,在基因功能研究、模式动物构建、基因治疗等方面具有广阔的应用前景。 该技术的原理是小向导RNA(sgRNA)引导cas9蛋白靶向基因组特定位点进行基因编辑。sgRNA序列特征、设计位置对于敲除的有效性及基因功能变化至关重要,那么s...
一、Cas9 靶位点的选择 1.Cas9 靶位点包含 20 个碱基,其中 5' 端应为 GG:紧邻靶点 3' 端的 3 个碱基构成 PAM 区,要求序列为 NGG(N 为任意碱基),可在正义链或反义链上选择靶位点。可参考如下的 Cas9 靶位点预测网站http://zifit.partner.org/zifit/csquare9nuclease.aspx。
(4)靶位点设计在外显子上,在基因上游越靠前越好。许多人类蛋白表达基因并不存在完全符合上述设计要求的特异性靶位点,即便某一基因存在特异性靶位点,也不能保证以该靶位点设计的 gRNA 能起高效引导作用。 二、sgRNA接头的使用 现在使用cas9质粒,常用BbsI和BsmBI酶切形成粘性末端链接sgRNA,所以我们根据我们使用cas9质粒...