Cas9 具有两个活性酶切位点,RuvC(D10)和HNH(H840)活性结构域,因此野生型Cas9剪切能切断DNA双链,若活性位点突变(D10A,H840A)将导致该位点酶切活性缺失(Cas9n和dCas9),CRISPR 相关衍生基因编辑工具如 CRISPRi, CRISPRa, CRISPR methylation/demethylation 等都是对Cas9改造后与相关作用原件形成融合蛋白发挥作用(...
设计好与靶序列互补配对的gRNA序列后，我们需要将gRNA构建至相应的敲除载体上，目前常用的方法是利用限制性内切酶酶切形成粘性末端后连接gRNA，所以需要根据我们使用的Cas9-gRNA质粒的酶切位点选择合适的接头。举例说明，若我们选用BsmBI为酶切位点的载体，BsmBI的接头如下图2所示，图2. BsmBI的接头设计 当我们锁定P...
RISPR-Cas9系统基本工作原理涵盖了一系列分子事件，从CRISPR序列适应外源DNA片段，通过转录和加工生成成熟的CRISPR RNA（crRNA）或合成单导RNA（sgRNA），到sgRNA与Cas9蛋白的复合形成。该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA，触发Cas9的内切酶活性，引发目标DNA的双链断裂。细胞察觉到断裂后...
如上图所示,序列中PAM和sgRNA的序列放大(前提是sgRNA位于CCDS区域,而且特异性要保证): 如上图所示,让Cas9切割位置(确定的)跨过一个酶切位点(比如sfcI)(在前两篇文章中都有所提及)。这样,在Cas9成功编辑靶序列产生indels的时候,酶切位点一定...
通常情况下,为了便于下游 KO mutants 的鉴定,我们往往可以作如上设计:即 Cas9 的切割位点刚好被一个酶切位点跨过,且附近至少 100 bp 内酶切位点唯一。 为了减少 Off-Target 效应,请把设计好的 Target 放在括号中的网址里去做预测,尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验。 20 nt 确定之后,请按照如上图所...
1、酶切载体 LentiCRISPR-V2质粒有两个BsmBI酶切位点,通过使用BsmB内切酶I,我们能够打开所需的区域。酶切条件遵循内切酶说明书,随后进行胶切、回收并备用。 2、寡核苷酸链引物退火 体系: 退火参数: 37℃ 30 分钟,95℃ 5 分钟,然后以每分钟降低5℃的速度将温度降到25℃ ...
1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图 2 相关载体图谱 2.1 中间载体 ,sgRNA载体(预设有BbsI酶切位点) 中间载体↑ 2.2 CRISPR/Cas9骨架载体,表达CAS9,同时有完整的sgRNA表达框 含有CAS9的骨架载体(骨架载体可以换成PX459、PX461,PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同种gRNA scaffold的质粒) 3. 基因组...
Cas9蛋白与 酶的功能相似。 (2)首先依据 的部分序列设计DNA片段A(负责编码相应引导RNA),再将片段A与含有Cas9基因的质粒B连接,以构建编辑水稻Q基因的CRISPR/Cas9系统基因表达载体(如图所示)。位点Ⅰ、位点Ⅱ分别表示 酶切位点。 (3)质粒B大小为2.5kb(位点Ⅰ与位点Ⅱ相隔60b),经酶切后的片段A大小为0.5kb(千...
B:若转染sgRNA表达质粒,则分别合成带有酶切位点剪切残基的guide sequences,退火后连入经BbsI酶切的pSpCas9(BB)-GFP/puro载体骨架中。如图: 注意:20 nt的guide sequences的末端可加一个C碱基(G-C碱基对)以促进U6启动子转录sgRNA的效率,oligo DNA设计序列的第一个碱基必须是G,如果你选取的Guide序列的第一个碱基...
通常情况下,为了便于下游KO mutants的鉴定,我们往往可以作如上设计:即Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过,且附近至少100 bp内酶切位点唯一。 为了减少Off-Target效应,请把设计好的Target放在括号中的网址里去做预测,尽量找到一条脱靶效应较小的来继续下游实验(http://crispr.)。