Cas9X针对不同单碱基突变的情况使用不同的Mutation载体策略:包括短同源臂可以使用Oligo引入突变,需要长同源臂的使用ssDNA引入突变。而针对难以操作的细胞系,将需要通过先构建Cas9稳转细胞株再进行gRNA和载体共转染来提高效率。Cas9X针对每个具体的位点、每个具体的细胞优化实验条件用来满足不同细胞系和不同位点突变的服务需...
在该修复路径中,需要将一段与预期编辑位点上下游紧邻序列具有高度同源性的DNA修复模板、特异的gRNA和Cas9核酸酶一起引入细胞中。在高度同源性DNA模板存在的情况下, HDR机制可以通过同源重组将一段DNA精准地插入特定的基因组位点。目前CRISPR/Cas9 Gene Knock in系统可用于目的基因引入点突变,从而模拟人类遗传疾病模型...
1.4、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系 按和上述同样的方法将Cas9质粒转染细胞,如果细胞用脂质体转染困 难,可采用电转。通过荧光标记观察转染效率,如果选择了带Neo抗 性的质粒,则同时用G418药物筛选。如果有FACS,可直接分选带荧 光的细胞。 或者当细胞长满培养皿时,将细胞消化成单细胞,采用有限稀释法, 接种96孔板。
1)由于整个流程时间较长,因此,首先要确认sgRNA是否具有活性,即先将sgRNA,Cas9导入工具细胞中(容易转染,细胞周期较短,容易培养,如HEK293T细胞),puromysin筛选后提取群体细胞gDNA进行PCR、测序,确定细胞基因组DNA能被编辑后,再在目的细胞株如神经细胞中进行编辑,特别是做基因编辑的动物模型,这一步必不可少。如果目的...
图1. CRISPR基因敲除细胞系实验步骤概况。 实验步骤 sgRNA和genotype primers的设计合成 sgRNA设计:对靶基因序列进行分析,筛选合适的靶位点,每个靶位点设计1条sgRNA。通常,将Cas9靶向编码功能蛋白结构域外显子的sgRNA比单纯靶向5'外显子更有可能消除基因功能。
④、⑤:Cas9蛋白-sgRNA形成复合物,在sgRNA的引导下Cas9结合于基因组DNA的特定序列,并对其进行切割; ⑥切割后的DNA会在细胞自身DNA修复过程(如同源重组)中修复,该过程中可发生碱基对的缺失、替换或增添(基因突变),也可利用同源重组进行定向敲除; ⑦、⑧改造后的DNA分子经过转录和翻译表达相应的蛋白质。
将蛋白与无核酸酶的 Cas9( Cas9 nuclease-null)融合,并表达适当的 sgRNA ,可靶定任何 dsDNA 序列,而 sgRNA 的末端可连接到目标DNA,不影响 Cas9 的结合,是继ZFN、ES 细胞打靶和 TALEN 等技术后可用于定点构建基因点突变大、小鼠动物的第四种方法,...
在这项研究中,作者在永生化HUVEC细胞系中使用CRISPR Cas9技术将HiBiT标签蛋白敲入E-选择素的N端,同时...
首先构建针对目标基因的CRISPR-Cas9敲除载体,然后将其显微注射到小鼠受精卵中。注射后的受精卵移植到代孕母鼠体内,得到基因敲除小鼠。;点突变技术;点突变原理;CRISPR-Cas9介导的点突变;;基因插入技术;;;CRISPR-Cas9技术挑战与前景;;;THANKS. VIP免费下载 下载文档 收藏 分享 赏 0下载...
B,C:载体构建流程图。2对设计好的靶点引物分别变性退火后,与gRNA2-LacZ-PU6a一起连入BsaⅠ线性化的pRC3或pRC6b,即可转化大肠杆菌感受态细胞。 图2 双靶点CRISPR/Cas9载体构建流程图 3 讨论 自2013年至今,基因编辑技术特别是CRI-SPR/Cas9系统,已...