通过优化,Cas9X在细胞系基因敲除的效率是传统质粒法的数倍(3-5倍)结合ClonePlus技术,可以将效率提升10-15倍,也可以针对很多之前难以实现敲除的细胞株进行基因敲除操作,而且周期比病毒法更短。最快可以5周内拿到基因敲除的细胞!基因敲除技术的应用及前景 1. 建立生物模型。在基因功能,代谢途径等研究中模型生物...
单克隆细胞a1的目的基因在sgrna2位置出现两种突变形式分别缺失1个和19个碱基在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子 CRISPRCas9基因敲除细胞株详细构建流程 Puro抗性浓度摸索实验 将细胞如下图1稀释。给药7天后,弃培养液,用台盼蓝染色2 min,显微镜下观察细胞存活情况。确定细胞多克隆细胞筛选和单克隆细胞...
即非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源介导的修复(Homology-directed repair, HDR),而基因敲除则利用的是NHEJ的修复方式,在Cas9切割诱导DNA双链的断裂后,细胞启动NHEJ修复机制,在修复过程中通常会发生碱基插入或
基因敲除技术优势 Cas9X使用新的实验模型将细胞系的敲除效率进行大幅的提升 1. 使用Cas9蛋白和gRNA的复合物直接进行电转,提高效率的同时减少非特异的切割;(目前报道脱靶率最低的方法) 2. 使用高效的电转设备,具备更高的电转效率和细胞存活率; 3. 使用更先进的单克隆稀释设备和方法,大幅提高阳性率;(提高2倍) ...
其中,人类细胞是最常用的细胞模型之一,可以用于疾病模型的构建、药物筛选和基础研究等方面。耐思Quick-KO®基因敲除试剂盒主要针对人类细胞、小鼠细胞等哺乳动物细胞开发。对于不同的目标细胞类型,我们需要根据细胞的特点和CRISPR技术的限制来选择合适的CRISPR-Cas9系统和转染方法。基因敲除细胞模型的构建对于基础研究和...
通常使用质粒载体或病毒载体等方法来将Cas9和sgRNA导入细胞。目前慢病毒是构建基因敲除细胞株的最佳工具,通过将编码Cas9蛋白的序列和sgRNA序列克隆至慢病毒穿梭质粒中,再用包装好的病毒感染细胞。4.实验细胞感染及基因敲除 利用慢病毒感染实验细胞,细胞成功表达Cas9和sgRNA。Cas9蛋白在sgRNA引导下对细胞基因组的靶标基因...
4]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术用于永生化HUVEC细胞系,成功获得仅敲除PECAM-1细胞质结构域的HUVEC细胞系...
图1. CRISPR/Cas9介导的基因编辑示意图 二、敲除单克隆细胞株的构建 1. 确定基因,选择合适的细胞系 根据研究内容确定待敲除的目的基因和细胞系。敲除前应首先通过网站查找预测、文献查阅等明确待敲除基因的功能并评估敲除此基因是否致死;在细胞系的选择上,优先选择容易转染且单克隆增殖能力较强的细胞。
赛尔瑞成采用CRISPR/Cas9系统,提供基因敲除细胞系构建服务。赛尔瑞成根据目的基因序列设计合成sgRNA,将Cas9和sgRNA基因转染目的细胞,进而敲除目的基因,并进行单克隆筛选,获得基因敲除单克隆细胞系。 CRISPR/Cas9系统作为新一代基因编辑工具,因其构建方便、设计灵活,操作简单、效率高成本低,成为基因敲除的新一代利器。该系统...
阳性单克隆细胞株验证 测序验证阳性单克隆细胞株的基因序列,以确定是否敲除成功。 实验结果示例: 该基因有两个单克隆细胞株,A1和A2。 单克隆细胞A1的目的基因在sgRNA2位置出现两种突变形式,分别缺失1个和19个碱基,在新序列的第337位和第355位碱基提前出现终止密码子。