首先是GUIDE-seq[1],其大概过程是首先将CRISPR质粒和特定序列的双链DNA转染进入细胞系,然后在Cas9剪切产生双链断裂并采用非同源修复时就有可能将转染进细胞的双链DNA整合到基因组中,之后提取基因组按照正常的二代测序建库流程建好文库后,经过一步半靶向扩增后再用二代测序检测相关脱靶位置。很明显这样检测的效率比较低,因为
另一方面,CRISPR基于sgRNA与基因组序列互补定位到靶位点,不论哪种CRISPR系统,都存在sgRNA序列不完全匹配但能够结合基因组的脱靶现象,CRISPR定位到脱靶位点引发序列改变就属于第二类风险。CRISPR技术诞生刚过10年,期间迅速取代TALEN和ZFN,成为学术界通用的基因编辑技术,也彻底改变了我们的生物学研究方法。为提高CRISPR技术的...
对于CRISPR/Cas9和TALEN处理过的细胞,研究人员在目标切割位点的60 bp内鉴定出成簇的IDLV整合位点(CLIS)。当他们寻找WAS和TAT基因以外的CLIS时,在TALEN处理的细胞中未找到脱靶位点,而在CRISPR/Cas9核酸酶中发现一些。之后他们利用芯片预测和深度测序来确定IDLV分析的灵敏度,发现它能够检测频率低至1%的脱靶切割。 Yee认...
CRISPR实验指南:检测CRISPR脱靶突变 张锋实验室的一位研究生:Winston Yan的项目就是利用CRISPR-Cas9基因组编辑系统的一个突变来敲除调控小鼠胆固醇的基因。“最终的目的是为治疗应用铺平道路,”Yan说,他最近完成了他的研究生工作,同时也第一次遇到CRISPR脱靶效应的问题。 CRISPR能帮助研究人员快速有效地对基因组进行有针...
尽管脱靶是一个重要的安全问题,使用CRISPR-Cas9进行精确的基因组编辑任然是遗传疾病有希望的治疗方法。使用CRISPR-Cas9系统进行基因编辑的主要限制是发生脱靶变异。 长度短于16个核苷酸的gRNA有效地将Cas9募集到基因组中的互补位点,但不让Cas9核酸酶激活。 在这里,我们描述了一种新的方法,CRISPR gRNA辅助减少损伤(CRISPR...
在体内基因组编辑过程中识别CRISPR-Cas的脱靶位点是临床翻译的一个障碍。DISCOVER-Seq依赖于内源性DNA修复因子,因此在体内编辑过程检测脱靶位点理论上是可行的。作者使用混杂的Pcsk9-gP gRNAs在小鼠体内比较测试了DISCOVER-Seq与一种目前常用的检测方法—...
2023年6月5日,武汉大学胡争团队在Med(IF=17)在线发表题为“Massively parallel CRISPR off-target detection enables rapid off-target prediction model building”的研究论文,该研究基于AID-seq,开发了一种混合策略,可以同时识别多个gRNA的靶向和非靶向效应,并利用混合的人类和人乳头瘤病毒(HPV)基因组来筛选416个HPV...
是签解决CRISPR/Cas9 系统的脱靶问题的一个多重来源。 二、CRISPR/Cas9 系统的脱靶效应的检测技术 1. 靶向测序技术 靶向测序技术是目前用亍检测CRISPR/Cas9 系统脱靶效应最常用的技术,其基本原理 是通过高通量测序技术对基因组DNA 迚行扫描,寻找Cas9 酶靶向RNA 和非靶向DNA ...
以往人们在检测CRISPR-Cas核酸酶诱导的脱靶DNA断裂时,往往事先假定脱靶位点与靶标位点相似。GUIDE-seq是首个不需要这样做的方法,而且它相当灵敏 。 一组研究人员利用一种短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas诱导的脱靶断裂,测序这些标签所在的基因组区域,就能够确定脱靶突变的位置。研究表明,就算某个脱靶突变的出现频率低...
图1:用于表征CRISPR-Cas9脱靶切割最常用的体外和体内实验技术 为检测核酸酶的脱靶活性,已开发出多种实验工具(上图)。分为三类:核酸酶结合物检测、核酸酶诱导DSB检测、核酸酶诱导DSB后修复产物检测。 尽管核酸酶结合是最容易被检测到的,但因为核酸酶结合对于切割来说是必要但不充分的,所以只依赖核酸酶结合来检测脱靶...