点突变一般采用单链寡核苷酸(ssODN)作为HDR模板,可以通过在PAM位点或者guide区域靠近PAM位点引入突变的方式,显著降低二次切割的概率。 如果点突变位点距离PAM位点较远(>10bp),通常可以在PAM位点附近引入同义突变,防止二次切割。如果PAM位点或者guide区域不在编码区域上,无法引入同义突变,则可以通过两步法进行实验:第一步...
研究发现，根据Western Blot检测到的NPC1蛋白特性，致病点突变可分为四大类：（1）突变型NPC1蛋白在表达量和分子量上均与野生型蛋白相似；（2）突变型NPC1蛋白表达量减少，但分子量无明显改变；（3）突变型NPC1蛋白表达量减少，分子量上可分为两条带：一条与野生型相当，另一条更小；（4）突变型NPC1蛋白表达...
ssODN:通过合成特定的单链寡核苷酸(ssODN),可以精确地引导CRISPR系统进行点突变或tag敲入。 HDR:同源重组修复(HDR)模板的设计,允许你在目标DNA上引入特定的突变或插入。 MMEJ:微同源修复(MMEJ)模板,通过短同源臂(~500-1000bp)来实现修复。🔧 实验步骤: SgRNA设计:选择合适的SgRNA,确保其能够精准切割目标DNA。 HDR...
CRISPR基因敲除细胞株,实现DNA水平的基因敲除、敲入或点突变。 CRISPR/Cas9系统的原理是利用gRNA特异性识别靶序列,并引导Cas9核酸内切酶对靶序列的PAM上游进行切割,从而造成靶位点DNA双链断裂,随之利用细胞的非同源末端连接(NHEJ)或同源重组(HDR)的方式对切割位点进行修复,实现DNA水平的基因敲除、敲入或点突变。 CRISPR基...
CRISPR/Cas9 系统已成为基因定点突变的强大工具。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御机制。 Cas9 蛋白是该系统中的关键核酸酶。在进行基因定点突变时,首先需要设计一段与目标基因特定序列互补的 guide RNA(gRNA)。gRNA 能够引导 Cas9...
检测:通常选择酶切进行检测。注意,很多突变位点没有酶切位点,因此在设计同源臂时,应尽量加入一个酶切位点,以便于检测。通过以上步骤,你可以有效地进行CRISPR Cas9点突变操作。希望这些信息对你有所帮助!0 0 发表评论 发表 作者最近动态 我个大明白晚桉 2025-02-08 百度企业认证全攻略:快速上手指南🎉想要......
CRISPR/Cas9助力攻克癌症肿瘤“大魔王”——KRAS KRAS基因是人体内的一个正常基因,但其突变常发生在各种类型的肿瘤中,大约有30%的癌症患者基因组中都存在KRAS基因突变,其中包括90%的胰腺癌,50%的结肠癌和25%的肺癌。 Figure1: KRAS突变在不同类型癌症中的突变比例,数据来源于AACR GENIE 9.0公共数据库[1] ...
利用CRISPR/Cas9技术构建定点突变小鼠品系 CRISPR/Cas9 技术原理 CRISPR/Cas9 系统源于细菌的适应性免疫防御机制。其中,Cas9 是一种核酸内切酶,在整个基因编辑过程中起着 “分子剪刀” 的关键作用。而引导 RNA(…
CRISPR-Cas技术概述CRISPR-Cas是一种基于细菌免疫系统的基因编辑技术,通过靶向特定基因序列实现基因敲除、点突变和基因插入等操作。CRISPR-Cas系统由CRISPR序列和Cas蛋白组成,CRISPR序列负责识别目标基因,Cas蛋白则具有切割DNA的功能。CRISPR-Cas技术具有高效、精确、灵活等优点,被广泛应用于基因功能研究、基因治疗、农作物遗...
CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒...