7分析Western Blot 或质谱检测分析沉淀的诱饵蛋白及与其结合的靶标蛋白。小贴士：内源性 Co-IP 实验可选择蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖；外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等)，可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠、Anti-c-Myc 磁珠...
1.选择经过IP验证的抗体：使用经过IP验证的抗体可以显著降低假阳性概率，因为这些抗体已经过专门优化，适用于免疫沉淀实验。2.考虑抗体的特异性：选择特异性强的抗体可以减少非特异性结合，从而降低杂带干扰。单抗通常具有更高的特异性，但也可能存在亲和力较低的问题。多抗虽然亲和力较好，但特异性可能较差，容易出现非...
免疫沉淀效果 极佳(由于亲和力高) 由抗体的亲和力决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 免疫共沉淀效果 通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性 有抗体的亲和力决定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反...
首先抗体对抗原(目的蛋白)进行特异性结合,接着通过偶联在微珠上的亲和蛋白(如Protein A sepharose beads)对抗体Fc端结合形成“beads-抗体-目的蛋白”三联体,经洗涤去除未结合的杂蛋白,然后 SDS sample buffer或酸性洗脱的方式使抗体、目的蛋白一起脱落下来,最后经Western Blot检测,胶片显影或仪器成像,观察是否有目的蛋...
2.Co-IP实验的步骤 2.1抗体选择：选择特异性和高亲和力的抗体，能够与目标蛋白质结合并稳定形成复合物。抗体的选择是Co-IP实验成功的关键。2.2细胞裂解：将目标蛋白质所在的细胞或组织进行裂解，释放出蛋白质复合物。在裂解过程中，需要加入适当的缓冲液和蛋白酶抑制剂以保持蛋白质的完整性。2.3免疫反应：将抗体...
那么实验中,既可以选择IP级别的抗体并配套相关凝胶/磁珠,也可以直接选用相关标签蛋白抗体凝胶/磁珠。 IP实验常见问题 免疫沉淀(IP)的原理是将抗体与固相载体结合后,利用抗原抗体特异性反应从纯化混合物中富集目的蛋白的一种方法。固相载体目前最常用的是免疫磁珠和亲和凝胶,免疫磁珠可以通过磁性吸附,快速精准的从混合...
内源性 Co-IP 实验可选择蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖;外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等),可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠、Anti-c-Myc 磁珠、Anti-GST 磁珠等),可一定程度增强丰度,减少 IgG 干扰。
答: Co-IP选择抗体尤为关键,特异性抗体可以排除非特异性结合进而排除假阳性。同时可以结合Co-IP反向验证进一步排除假阳性。若抗体浓度过高,则降低抗体浓度;若抗体特异性不好,则更换抗体。 8、质谱结果几百个怎么分析可能的互作蛋白? 答:如果蛋白较多,建议先做功能注释,从中选择与研究方向功能相关的蛋白;在这些蛋白通...
推荐先通过文献查阅或咨询供应商,选择已证实可用于Co-IP实验的抗体;如果无相关的抗体特异性数据,应先使用缺乏诱饵蛋白的细胞总蛋白作为阴性对照进行沉淀以确定该抗体无法沉淀任何非特异性蛋白,使用含有诱饵蛋白的蛋白溶液作为阳性对照确定该抗体可沉淀目的蛋白。此外,某些高质量抗体也可能出现非特异性结合,应使用与目标...
在这里,您轻轻地打开您的细胞,使您的蛋白质接触到抗体。 裂解方法在 Co-IP 中很重要。 非去污剂、低盐裂解缓冲液是可溶性蛋白质 Co-IP 的流行选择。 这种裂解最不可能干扰任何蛋白质相互作用。 然而,对于溶解度较低的蛋白质复合物,裂解缓冲液可能需要包含非离子去污剂,例如 NP-40 或 Triton X-100。 留出时...