众所周知，Co-IP是研究蛋白与蛋白相互作用的技术，基于抗体和抗原特异性结合的原理，采用结合了目标蛋白抗体的beads，调取样本中天然结合的目标诱饵蛋白（Bait）及其互作蛋白，去除未结合的蛋白后，再将复合物从beads上洗脱下来，进行后续western-blot或质谱鉴定。由上图可知，免疫沉淀复合物包括：Beads、抗体（约25kD的...
①IP:说明用什么抗体拉的,这里是利用CXCR3作为诱饵蛋白,用它的抗体下拉蛋白 ②用CXCR3抗体与其本身结合,出现条带,说明抗原抗体结合没有问题 ③CXCR3和Beclin1相互作用 ④内参组全部是阳性结果,阴性对照全部是阴性结果,才能确保实验可信 ⑤IB:是WB所用到的抗体 ⑥内参:制备完样品之后,对所有的蛋白进行WB直接得出的...
在样本易于转染的情况下,IP实验常常采用第6种方法,因为它避开了IP抗体售价高和品质不稳定的问题,成本低、调取效率高。 当真正实验时,却发现磁珠上的标签抗体也会残留在IP洗脱液中,这是因为抗体的两条重链和两条轻链蛋白很难同时偶联在beads上,当用到强烈的洗脱方法时,仍然会有掉落风险。 近年来,越来越多人选择...
方案3:使用HRP直标一抗作为WB检测抗体 方案4:使用抗体偶联beads进行IP捕获 总结 相关阅读推荐 在上一期实验干货中,小P详细梳理了一下免疫沉淀(IP)实验原理、流程和难点,还没看过的小伙伴可以点击本段文字直达哦(还有IP/Co-IP讲座回放可点击Proteintech视频号查看)。文章发出之后,有一些小伙伴希望小P就检测时出现的...
免疫沉淀效果 极佳(由于亲和力高) 由抗体的亲和力决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反应的抗体组成单克隆抗体群) 免疫共沉淀效果 通常很好,但有时非特异性相互作用会带来假阳性 有抗体的亲和力决定和抗原表位是否被相互作用蛋白遮蔽决定(极佳或极弱) 极佳(由于选择可以成功进行IP且没有交叉反...
IP（免疫沉淀）/Co-IP（免疫共沉淀）实验中消除杂带干扰确实是一个关键问题，其中抗体的选择至关重要。以下是一些消除杂带干扰的策略，特别是关于抗体选择的建议：一、抗体选择策略 1.选择经过IP验证的抗体：使用经过IP验证的抗体可以显著降低假阳性概率，因为这些抗体已经过专门优化，适用于免疫沉淀实验。2.考虑抗体...
Co-IP抗体和磁珠结合的原理是利用特异性抗体将目标蛋白与其他相互作用蛋白一起沉淀下来。 具体步骤如下: 1. 将目标蛋白和其相互作用蛋白混合,在适当的条件下使它们形成复合物。 2. 加入特异性抗体,使其与目标蛋白结合。 3. 添加蛋白A/G磁珠,这些磁珠可以结合抗体。 4. 将混合物在低温条件下轻轻摇动,使抗体与...
内源性 Co-IP 实验可选择蛋白 A/G 磁珠或蛋白 A/G 琼脂糖;外源性 Co-IP 实验中蛋白携带标签 (如 Flag、HA、c-Myc、GST 等),可以选择标签抗体类磁珠/琼脂糖凝胶珠 (如 Anti-Flag 磁珠、Anti-HA 磁珠、Anti-c-Myc 磁珠、Anti-GST 磁珠等),可一定程度增强丰度,减少 IgG 干扰。
解决免疫共沉淀(Co-IP)中的抗体轻重链污染问题 1.免疫共沉淀-互作研究经典方法 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,CoIP)是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法,常用于发现蛋白的互作网络、鉴定两蛋白的互作关系。 CoIP的设计原理是,假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员,那么利用这种蛋白的特异性抗体,就可...