Co-IP裂解液是一种非常温和的裂解液,主要用于免疫共沉淀实验。相比于其他裂解液,Co-IP裂解液不仅能够保持目标蛋白质的天然活性,还能保持与目标蛋白相关联的蛋白质连接不受影响。同时,对于大多数酶切类实验所用酶的活力也无干扰。因此,Co-IP裂解液是进行Co-I...
随后观察IP（α-GFP）组，阴性对照组为利用GFP标签抗体磁珠对GFP标签空载体和Protein B-FLAG混合表达的裂解液进行免疫沉淀，结果只显示检测到GFP标签空载体的条带，说明GFP标签空载体和Protein B-FLAG没有发生互作，证明了互作的特异性。另一组则是利用GFP标签抗体磁珠对Protein A-GFP和Protein B-FLAG混合表达的裂解...
2.大多数免疫沉淀实验需在 4℃下进行，同时依据实验目的提前将蛋白酶抑制剂和或磷酸酶抑制剂添加到裂解液中 3.IP/Co-IP 实验的成功与否与蛋白样品质量（抗原质量）息息相关，选择合适的蛋白制备方案，提高蛋白样品质量是实验的成功必要条件。
6、4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中标号Input,留Protein A珠子,标号IP。 7、变性以及还原蛋白 室温溶解蛋白上样缓冲液(5×),按照4 uL蛋白样品+1 ul (5×)的比例混合,IP组加入50ul蛋白上样缓冲液,在蛋白样品中加入含SDS(保证样品中的所有蛋白带电荷一致)的上样缓冲液,100℃加热煮沸,以...
IP样本一般建议新鲜制备并立即使用,如有需要可保存在-80 ℃。 2)预纯化 阴性对照的选择: 与IP抗体同源同型(亚型)的抗体:如 Rabbit IgG;Mouse IgG1, etc; 取与IP实验等量的裂解液,使用Isotype Control孵育;与IP抗体孵育同时进行。 Isotype Control选择: ...
根据实验条件,对应选择适合的孵育方法。 方法一:样本与目标蛋白的共孵育 IP抗体+裂解液→加入Protein A/G→Wash→Elution; 【特点】得率及蛋白纯度最高 方法二:抗体与微珠的共孵育 IP抗体+ProteinA/G→Wash→加入裂解→Wash→Elution; 【特点】当抗体不够纯时,使用此方法,先去除抗体的非特异性结合。 方法三:...
RIPA裂解缓冲液(Co-IP/IP)对细胞有一定的裂解能力,能获得较多的胞浆蛋白,而对细胞核的裂解能力有限,不能完全裂解细胞核,因此获得的总蛋白适用于IP或CO-IP实验。 可很好的释放胞浆蛋白,部分释放膜蛋白和核蛋白。 经Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer,核蛋白与DNA还紧密结合在一起,离心后会造成核蛋白的丢失。 对于...
根据实验条件,对应选择适合的孵育方法。 方法一:样本与目标蛋白的共孵育 IP抗体+裂解液→加入Protein A/G→Wash→Elution; 【特点】得率及蛋白纯度最高 方法二:抗体与微珠的共孵育 IP抗体+ProteinA/G→Wash→加入裂解→Wash→Elution; 【特点】当抗体不够纯时,使用此方法,先去除抗体的非特异性结合。
·裂解液准备：确保裂解液冰冷，加入Protease Inhibitor和RNase Inhibitor防止蛋白质和RNA降解。·梯度分离：蔗糖梯度的准确配制和离心条件对分离效果至关重要。·IP操作：特异性抗体的选择和洗涤步骤的彻底性对实验结果的纯度影响重大。·RNA提取与反转录：充分相分离确保RNA纯度，反转录反应条件优化以提高cDNA质量。结果...
CO-IP(免疫共沉淀)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X结合的蛋白质Y也能沉淀下来。一、蛋白样品制备裂解提取出免疫沉淀需要的蛋白样品,以下为HEK293T细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献。单层贴壁细胞总蛋白的提取:1、...