为了得到准确的表达水平,需要使用chip-qpcr计算公式进行修正。该公式的基本原理是通过内部参照基因和标准曲线来校正荧光信号的强度,从而得到准确的相对表达水平。 选择一个稳定表达且与目标基因无关的内部参照基因作为参照。这个内部参照基因应该在样本中的表达量相对稳定,不受外界因素影响。常用的内部参照基因有GAPDH、β-...
其他引物依次这样做就行。 二、ChIP-qPCR实验及结果计算: 最后,我们就是用抗体做ChIP了。一些样本分为input组(看你自己选取百分之几的样作为input,这个要记住,后面要计算的。我们一般推荐1%-5%),剩下的样平均分为抗体组和lgG组。 那最后这三组DNA需...
2. 计算百分比 % Input = 2 ^(-ΔCt [normalized ChIP]) 对于后面的问题,还要有一些计算, 3. 要加入阴性对照的Ct值 ΔΔCt [ChIP/NIS] = ΔCt [normalized ChIP] - ΔCt [阴性] 4. 计算Assay Site IP Fold Enrichment Fold Enrichment = 2^ (-ΔΔCt [ChIP/NIS]) 5. S1和S2的比值计算 ΔΔ...
在完成IP实验以及引物设计合成后,就可以进行qPCR实验啦。对每个样本(单个样本通常需要做3个技术重复)的Input、IP、IgG-DNA进行qPCR实验,统计每个复孔的CT值,随后利用2-△△CT法进行富集倍率的计算。 计算公式如下: ΔCt [normalized ChIP] = (Ct [ChIP] - (Ct [Input] -Log2 (Input Dilution Factor)) Inpu...
我们的input通常为总量的1/10，即稀释了10倍，Log2 (Input Dilution Factor)≈3.3 计算示例：inputH3...
计算CHIP-qPCR 富集效率时,一般是以相对Input信号富集比例来呈现的,例如若做了单个2%Input,计算公式如下: 注:CT 值一般是指2-3次重复实验的平均CT值 而CST 一直推荐通过稀释不同比例的Input 来先建立qPCR 的标准曲线,标准曲线一般用来确定qPCR的反应效率。低扩增效率(小于90%)可能由于Taq酶抑制剂的污染、过高或未...
有两种ChIP完定量的计算方法: 1)双△CT法; 2)双标准曲线法。 双△CT法的特点 1. 双△CT法的一大特点是,当优化的体系已经建立后,在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线,而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。 2....
最后计算IP与IgG均一化之后扩增循环数差异(△△CT),并通过2-△△CT计算富集倍数。 实验流程 一、ChIP富集实验 ChIP-qPCR的富集实验与ChIP-seq实验一致。 1、首先是利用1%的甲醛对样本进行交联,以固定蛋白-DNA的结合状态; 2、随后对染色质进行提取和片段化(超声打断或酶切),此时取出一部分染色质(一般是2%Input...
最后计算IP与IgG均一化之后扩增循环数差异(△△CT),并通过2-△△CT计算富集倍数。 实验流程 一、ChIP富集实验 ChIP-qPCR的富集实验与ChIP-seq实验一致。 1、首先是利用1%的甲醛对样本进行交联,以固定蛋白-DNA的结合状态; 2、随后对染色质进行提取和片段化(超声打断或酶切),此时取出一部分染色质(一般是2%Input...
双△CT法的核心是利用Input作为对照，通过计算IP（富集产物）与IgG（阴性对照）的CT值差异，确定富集倍数。实验流程包括：首先，进行ChIP富集实验，包括甲醛交联、染色质提取、抗体富集和纯化；然后，设计引物，保证产物长度适中，如150bp，引物应具有高特异性；引物设计可参考seq结果、可视化软件、数据库或...