Input管是按照一定比例分出的原始样本(在ChIP中是指断裂后的原始基因组DNA片段混合物,未进行抗体结合),一般采用1%的比例,在下游荧光定量PCR数据分析时需要把这个1%的比例换算为100%整体样本,以便作为目的DNA片段全部的量用于计算沉淀富集的目的DNA片段的占比。提示:在ChIP-seq实验中可以不设置IgG管,因为阴性对照...
它通过多种蛋白质组学和分子生物学方法,包括交联、细胞裂解(蛋白质-DNA提取)、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA样本回收,将蛋白-DNA复合物分离出来进一步研究特定的结合蛋白或与其结合的DNA,同时结合qPCR(ChIP-qPCR)可用于检测已知蛋白与特定结合位点的DNA是否结合以及结合的强度,结合二代测序(ChIP-seq)可用于分析...
(A) 11个ENCODE ChIP-seq数据集,使用Peak-seq(0.01%FDR截止值)calling的peaks数。 (B) peaks calling和唯一比对reads数之间的关系,为11个ChIP-seq数据集calling peaks数。插图为HepG2细胞的MAFK数据集的peaks数据,该数据集是目前测序最深的ENCODE ChIP-seq数据集(由于相对于其他数据集的reads明显较大,因此单独显...
有两种产生对照DNA样本的基本方法减轻了这些问题对结合位点鉴定的影响:(1)从与免疫沉淀DNA相同条件下交联和片段化的细胞中分离DNA (“Input” DNA);(2)使用与不相关的非核抗原(“IgG”对照)反应的对照抗体进行“模拟”ChIP反应。对于这两种类型的对照,编码组序列的深度至少等于且优选大于ChIP样本的深度。虽然IgG对照...
(C) 随着测序深度的增加,新calling peaks值的富集倍数变化。每增加2.5M唯一比对reads,计算新calling peaks与IgG对照数据集(在相同测序深度下测序)相比的中位数富集倍数,并将其绘制成图表。 ChIP信号强度与生物调节活性的关系是当前积极研究的领域。已知增强子的生物活性在文献中被定义,并且与ChIP-seq信号强度相比,其分...
问题四:ChIP-seq为什么要做Input? 超声破碎过程中DNA的断裂不随机的,尤其是开放染色质区域,在超声样本中优先积累,已发表文章结果表明未经过IP的样本超声破碎后会产生数量不小的peaks;同时IP过程中会发生非特异性结合的情况,Input对照可以协助排除IP结果中的假阳性peaks。关于阴性对照:由于非特异性结合,IgG原则上不能结...
(C) 随着测序深度的增加,新calling peaks值的富集倍数变化。每增加2.5M唯一比对reads,计算新calling peaks与IgG对照数据集(在相同测序深度下测序)相比的中位数富集倍数,并将其绘制成图表。 ChIP信号强度与生物调节活性的关系是当前积极研究的领域。已知增强子的生物活性在文献中被定义,并且与ChIP-seq信号强度相比,其分...
问题四:ChIP-seq为什么要做Input? 超声破碎过程中DNA的断裂不随机的,尤其是开放染色质区域,在超声样本中优先积累,已发表文章结果表明未经过IP的样本超声破碎后会产生数量不小的peaks;同时IP过程中会发生非特异性结合的情况,Input对照...
对于这两种类型的对照,编码组序列的深度至少等于且优选大于ChIP样本的深度。虽然IgG对照比“Input”对照更接近于模拟ChIP实验,但重要的是,IgG对照免疫沉淀可恢复足够的DNA,以建立一个与实验样品具有足够高复杂性的文库;否则,使用该对照进行的结合位点识别可能会有很大偏差。
做ChIP实验时经常要设置非特异抗体IgG为阴性对照,那么ChIP-seq需要用IgG富集的产物进行背景噪音的去除吗?No!一般不建议用IgG产物作为ChIP-seq的对照,原因如下: 大多数IgG抗体与转录因子或组蛋白抗体不是来源于同一动物的免疫前血清。 IgG通常能富集到很少的DNA,导致后期建库过程中PCR循环数增加,不能达到作为对照去除背...