ChIP-qPCR 数据需要针对可变性来源进行标准化,包括染色质数量、免疫沉淀的效率(富集效率)和 DNA 回收率。 两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据方法——Percent Input法和富集倍数法(Fold Enrichmen)。与input相关的ChIP-qPCR数据包括ChIP的背景水平和input染色质的标准...
二、ChIP-qPCR实验及结果计算: 最后,我们就是用抗体做ChIP了。一些样本分为input组(看你自己选取百分之几的样作为input,这个要记住,后面要计算的。我们一般推荐1%-5%),剩下的样平均分为抗体组和lgG组。 那最后这三组DNA需要测浓度,一般来说,转录因子...
图2 真阳性ChIP–qPCR 结果 而假阳性的结果是图3这样的,主要的原因是IP 下来的DNA没有或不足 、PCR条件不合理等。
一般只有通过ChIP-qPCR或ChIP-PCR验证才能确定ChIP成功与否。通过ChIP-qPCR判断 ChIP成功与否是通过比较目的蛋白在阳性区域和阴性区域的富集度差异来判断的。 阳性区域比阴性区域富集度高4-8倍以下(也就是2-3个cycles),我们可以认为ChIP没有 成功;如果在4-8倍以上,说明目的蛋白在阳性区域有富集,可以初步认为ChIP成功...
如果过度片段化可能破坏抗原表位降低PCR效率，片段化不全导致样本丢失，可能会获得假阴性结果。关于抗体 20...
首先，我们使用 coverage() 函数创建一个包含我们的覆盖率分数的 RLElist 对象。forBigWig <- coverage...
4、对Input、IP进行建库和测序可进行ChIP-seq分析,设计引物进行qPCR则为ChIP-qPCR实验。 二、引物设计 2-△△CT法计算原理会假设目标基因在不同的富集产物中的PCR效率基本相似,且ChIP在富集时会对DNA进行打断,因此在引物设计时,产物的长度不宜太长,通常150bp附近最佳。
数据分析 ChIP的结果如何分析? 任何ChIP反应的最后一步是分析免疫沉淀的DNA。研究人员通常会通过PCR或NGS方法分析分离的DNA序列。 如果您已经知道您感兴趣的位点并且需要研究的区域不是很多,那么使用qPCR进行分析是一个不错的选择。如果您想了解目标蛋白在整个基因组中的结合位点,那么需要进行建库NGS测序。
两种常用的标准化 ChIP-qPCR 数据分析方法——Percent Input法和富集倍数法(Fold Enrichment)。建议ChIP 实验设置样本的生物学重复,尽可能将结果信号和标准差一起显示。 Input百分比法(Percent Input法) 建议采用此方法进行荧光定量PCR数据分析 简言之,这种方法的思想就是:把每次免疫沉淀获得的靶信号表述为占总Input样...
富集倍率大于2一般被视为富集，但实际应用中，可能需要结合其他验证技术来确认。为了保证结果的可靠性，通常建议做3个生物学重复。总的来说，ChIP-qPCR验证是ChIP-seq分析后的关键验证步骤，通过合理的实验设计和严谨的数据分析，可以有效地确认蛋白-DNA相互作用的实际情况。