我们先如下打开NCBI的引物设计页面: 在这个页面设计引物的时候,我们只要修改产物长度就行,我们只要100-150bp左右的产物就行,对于做ChIP-qpcr来说的话。因为如果你设计太长了,在你做ChIP的时候如果超声把DNA打的太短,你就验证不出来了。所以我们一般建议大...
因此,我们准备做ChIPqPCR验证该结合。先将该区域放大可视化150-200bp左右: 随后选中上面哪个红色的,左右各点击一下示意选中该区域,并右键复制序列: 打开snapgene(点击下载免费的安装包),将该序列保存起来(此时注意,上面我们可以看到WNT4是从右到左的,我们复制的时候序列也是...
共享的Hi-C的数据集可以提供: 染色质高级构象组合的可能性,为3C-qPCR以及ChIP-qPCR检测提供引物设计的序列及方向指导。这个部分是“数据驱动”模块。 3C-qPCR以及ChIP-qPCR可检测到的,一种蛋白因子对一列DNA序列的组合才是功能和机制研究的关键。这个部分是“数据驱动”后的“实验验证”模块。 3C-qPCR以及ChIP-qPC...
因为ChIP-qPCR使用的模板就是来自genomic DNA,是很多“碎小”的原始基因组DNA,最常见是基因的启动子区域或者转录起始位点TSS上下游的2kb左右的区域(可能会包含外显子区域),所以这时候使用在线qPCR引物设计软件或是仪器自带引物设计软件的时候,一定要清晰的明确这一点,要把这个模板区域的序列信息“告知”仪器或是软件,...
ChIP-qPCR结果展示模式可视化如下: Cell 2011 1,最上一栏,为基因组功能序列注释的排列。 2,下4栏为4种不同基因组DNA结合蛋白进行ChIP实验的结果展示。(横标为基因组位置,纵标为Inp,相较与背景DNA的“倍数”) 3,A-I柱图表示不同DNA区域。样本差异程度通过星号*来标识。
ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。 普通逆转录qPCR引物设计里一个很重要的原则是引物序列要跨内含子,目的就是把cDNA模板和genomic DNA模板区分开来,避免引物结合到残留的genomic DNA模板上,导致假阳性非特异性扩增信号。 而在ChIP-qPCR的引物设计中,则不需要这样,如果这样做,对有些组蛋白修饰的位点...
ChIP-qPCR和普通逆转录-qPCR的引物设计有很大不同。 普通逆转录 qPCR引物设计里一个很重要的原则是引物序列要跨内含子,目的就是把cDNA模板和genomic DNA模板区分开来,避免引物结合到残留的genomic DNA模板上,导致假阳性非特异性扩增信号。 而在ChIP-qPCR的引物设计中,则不需要这样,如果这样做,对有些组蛋白修饰的位...
去除染色质交联之后,使用典型的酚-氯仿及随后的乙醇沉淀方法或使用 DNA纯化柱试剂盒来进行DNA纯化。一旦完成了 DNA 纯化,便可进行多种下游分析,包括ChIP-qPCR、ChIP-芯片和ChIP-seq。 三、ChIP实验重点实验细节 1、交联 内源状态下,蛋白和DNA的结合多数是动态的,交联能实现捕获特定时间内蛋白和DNA结合的情况。交联...
然后通过qPCR对样品进行简单的检测,比如设定合理对照。 再送往公司采用微量建库的方法建库测序。 ChIP-seq测序数据分析 以下程序运行在ubuntu环境。 数据分析过程主要使用测序获得的fastq原始文件进行下一步分析。 下图表示的是通常情况下,一组高通量测序的数据流转流程。
染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP)是于生物体内研究蛋白质与DNA相互作用的方法。其原理是在活细胞或组织的状态下固定蛋白质-DNA复合体,再将染色质DNA随机打断成小片段, 通过目的蛋白的特异性抗体富集与目的蛋白结合的DNA片段。通过PCR或qPCR技术检测富集产物中的特定DNA片段的含量可以定性分析目标蛋白...