将这两个保守的核酸内切酶结构域进行突变,其中RuvC催化结构域的第10位天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)以及HNH催化结构域的第840位组氨酸突变为丙氨酸(H840A),Cas9蛋白将失去核酸内切酶活性,失去活性的Cas9称之为dead Cas9(dCas9)(Qi et al., 2013)。
通过将RuvC（D10A）和NHN（H840A）两个核酸酶结构域分别进行氨基酸突，从而得到一个没有核酸酶活性的Cas9蛋白，使其失去切割DNA的功能，但仍保留结合DNA的能力，这样的Cas9 称之为dCas9（Dead Cas9）。目前CRISPR/dCas9系统常用于基因组转录调控，用以激活或抑制特定基因的表达，从而达到研究基因功能的目的。图1....
CRISPR - Cas9 系统是细菌和古细菌在长期进化过程中形成的一种适应性免疫防御机制，用于抵御外来噬菌体或质粒的入侵。在这个系统中，CRISPR 序列转录产生的 crRNA（CRISPR - derived RNA）会与 tracrRNA（trans - activating crRNA）结合形成复合物，引导 Cas9 核酸酶识别并切割与 crRNA 互补配对的外源 DNA 序列。dCa...
细胞内的非同源末端连接方式(NHEJ)会导致断裂位点随机插入、删除等突变,从而在特定位点引入突变。dCas9 是通过抑制 Cas9 核酸酶的 RuvC 和 HNH 两个结构域的活性得到的。dCas9 系统只有结合基因组序列的能力,却没有在基因组序列上切割的能力。CRISPR/dCas9 系统分别融合一个激活元件或一个抑制元件时,会产生基因激...
dCas9:一种可逆的基因编辑工具 一、Cas9的结构和功能 Cas9是一种来源于细菌的核酸酶,能够识别和切割特定的DNA序列 Cas9由两个结构域组成:RuvC-和HNH-,分别负责切割DNA的两条链 Cas9需要与单链RNA(sgRNA)结合,才能定位到目标DNA上 二、dCas9的制备和特点 dCas9是一种失活的Cas9变体,通过点突变使RuvC-和HNH-...
在“谈谈CRISPR/dCas9系统的“百变”应用(一)”中伯小远主要给大家讲解了CRISPR/dCas9的基础背景知识,以及该系统在基因的激活与抑制、表观基因组编辑(DNA甲基化修饰、组蛋白修饰)这两个方面的应用情况。除此之外,CRISPR/dCas9系统在基因组学研究中的应用还包括:单碱基编辑、靶向染色质拓扑结构、植物活细胞染色质...
DCas9，即失活的CRISPR/Cas9系统，已经成为生物学领域中一种独特而重要的工具。它通常用于基因沉默以及调控的研究中；能够精准地干预特定基因的表达。DCas9消光系数是一个与光学相关的参数；却在很多人的认知中，可能是一片空白。那它到底意味着什么？在科学实验中，消光系数是衡量物质对光地吸收以及散射能力的一个...
CRISPR/dCas9的应用领域 1. 基因激活与抑制 通过将dCas9与转录激活因子如VP64、EDLL融合，可以实现特定基因的转录激活。在植物中，dCas9与EDLL融合的系统能够强烈诱导内源基因的转录激活。此外，dCas9-SAM系统通过sgRNA的修饰，可以招募额外的转录激活因子，从而增强激活能力。2. 表观基因组编辑 CRISPR/...
安全、精准的长片段外源DNA的插入，从而第一次揭示了无切割基因编辑工具的可行性和应用潜力。图1：dCas9-SSAP 工作原理 图2：与经典CRISPR基因编辑需要对DNA进行切割会产生随机突变，而dCas9-SSAP则不需要切割DNA可实现精确编辑 原文链接：https://doi.org/10.1038/s41556-021-00836-1 ...
(1) dCas9- 转录调控蛋白融合系统; 基于sgRNA 引导dCas9 识别并结合目的基因DNA 的原理,研究人员将不同的转录激活结构域直接与dCas9 蛋白融合,利用dCas9的DNA 结合活性,直接( 或间接) 将各类转录激活因子携带到目的基因的转录起始位点上游,通过转录激活因子直接招募转录起始复合物,实现目的基因的激活。按照转录激活...