PAM 序列是 CAS9 蛋白与靶 DNA 结合的关键结构,它能够与靶 DNA 上的 PAM 识别序列(通常为 NGG)形成氢键,从而实现特异性识别。在识别到 PAM 序列后,CAS9 蛋白能够通过其核酸酶活性,在靶 DNA 上精确地切割出与引导 RNA 互补的序列。这一过程对于基因编辑、基因敲除等应用具有重要意义。 三、PAM 序列的分类 根...
近日，相关论文以《DNA 拓扑结构调节 PAM-Cas9 相互作用和 DNA 解旋，以实现嗜热 Cas9 近乎无 PAM 的切割》（DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near-PAMless cleavage by thermophilic Cas9）为题发在 Molecular Cell（IF 19.3）上，武汉大学医学研究院博士研究生史亚晶、段...
而在不久前,她和团队在 Molecular Cell 发了一篇新论文,揭示了基因组编辑工具 PAM-Cas9 的互作新机制,也提出了 DNA 构象可以直接影响基因编辑效率的新理论。 评审专家认为这是一项激动人心的研究,所发现的首个天然具备广谱 PAM、且高活力的 Cas9 蛋白,照亮了 Cas9 和 PAM 互作的新方向,为研发不依赖 PAM 序列...
Cas13a只需要24个碱基的crRNA，它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用，并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样，Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配，不过若存在2个错配，那切割效率就大大降低。它的PFS序列（相当于PAM序列）位于间隔区的3’端，由A、U 或C碱基组成。Ca...
简单来说,Cas9蛋白包括了几个关键的结构域,它们发挥着各自的关键功能。例如,HNH和RuvC结构域是Cas9的“剪刀”,分别切割目标链与非目标链;PI结构负责识别、定位PAM序列……相比之下,参与PAM和sgRNA识别的WED结构域似乎没有那么重要,甚至并非...
近日,相关论文以《DNA 拓扑结构调节 PAM-Cas9 相互作用和 DNA 解旋,以实现嗜热 Cas9 近乎无 PAM 的切割》(DNA topology regulates PAM-Cas9 interaction and DNA unwinding to enable near-PAMless cleavage by thermophilic Cas9)为题发在Molecular Cell(IF 19.3)上,武汉大学医学研究院博士研究生史亚晶、段敏以及云...
gRNA -靶向链 (TS) DNA异质双链种子区PAM -近端错配通常对底物DNA的结合和R -环的形成有显著影响。相反，PAM -远端错配与稳定的结合一致;但是，它们的存在往往会导致形成催化能力不足的复合物。此外，Cas9已被证明可以切割含有相对于gRNA序列插入或删除的脱靶底物，认为是通过gRNA- ts DNA异质双链中的核苷酸“...
研究揭示其和PAM互作的新机制，发现除了经典氢键互作之外，AtCas9的特殊loop结构可嵌入DNA大沟，且其嵌合度受DNA构象调控，实现对特定DNA构象进行不依赖PAM的任意切割。此外，虽然AtCas9的最适酶活温度是55C，AtCas9可在哺乳动物细胞中表现出高效的碱基编辑活力，在多个位点达到60%的编辑效率。GUIDE-seq脱靶分析显示,...
PAM序列在我们的DNA中也很常见,因此CRISPR-Cas9已被用于编辑人类基因组,但是有一定的限制性,不接近PAM的基因不能作为靶点。没有一个相邻、可识别的PAM序列,Cas酶将无法识别或成功附着并切割所需的DNA片段。 包括经典的化脓性链球菌Cas9的变体(SpCas9)在内不同的Cas酶可识别不同的PAM序列,但基因组的大部分仍然无法...
2020年3月27日,来自哈佛医学院和麻省总医院的Benjamin P. Kleinstiver(【1】的一作)实验室在Science杂志上发表了题为Unconstrained genome targeting with near-PAMless engineered CRISPR-Cas9 variants的论文。文章再度对SpCas9蛋白进行了强势升级,改造后的SpCas9突变体SpRY几乎完全摆脱了PAM困扰,其识别的PAM序列涵盖NR...