如果需要使用高浓度 Spy Cas9 核酸酶(M0386T和M0386M)用于体外 DNA 酶切,需要在配制反应体系之前,使用稀释液 B(NEB#B8002S)将酶稀释至 1 µM。 参考文献 Jinek M. et al. (2012).Science. 816-821 doi: 10.1126/Science.1225829. Epub 2012 Jun 28.. PubMedID:22745249 ...
1、特异性：确保sgRNA是特异性的，以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域，特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。2、GC含量均衡：sgRNA的GC含量应该在40-60%之间，以确保在实验条件下有适当的稳定性和杂交性。3、避免多个剪切位点：选择只有一个目标剪切位点的sgRNA，以避免非预期...
3、连接 体系:一般室温放置20-30分钟(NEB的快速T4连接试剂盒) 4、质粒转化: ①从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟; ② 冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟; ③ 加入500 ...
3、连接 体系:一般室温放置20-30分钟(NEB的快速T4连接试剂盒) 4、质粒转化: ①从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟; ②冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟; ③加入500 μL...
体系:一般室温放置20-30分钟(NEB的快速T4连接试剂盒) 4、质粒转化: ①从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟; ②冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟; ...
体系:一般室温放置20-30分钟(NEB的快速T4连接试剂盒) 4、质粒转化: ①从-80℃存储的Stbl3感受态细胞中取出并解冻,将5-10µL连接产物轻柔吹混匀后加入感受态细胞,接着在冰上孵育30分钟; ② 冰上孵育后,将感受态细胞放入预调至42℃的水浴锅中进行90秒的热激,然后返回冰上孵育10分钟; ...
Cas9用蛋白酶K灭活,并用SPRI珠纯化去除。参照先前描述的详细方法,按NEBNext Ultra II文库制备试剂盒(New England Biolabs,Ipswich,MA)操作流程,对样品进行加尾,然后进行Illumina测序。首先使用ARG-ANNOT检测AMR基因,对检测到dpM >0.的基因再与单独使用DNA-seq相比,进行富集评估。
图2：检测转染的293细胞中的Cas9。用Cas9的哺乳动物表达载体瞬时转染细胞或模拟转染细胞。哺乳动物表达载体或模拟转染。48小时后，用RIPA缓冲液裂解细胞。并测定蛋白浓度。Cas9 ELISA试剂盒在没有细胞裂解液的情况下进行。在没有细胞裂解液（阴性）、有50纳克/毫升Cas9核酸酶（阳性）（NEB目录号M0386）、有10微克蛋白...
其在Ｃ２Ｃ１２细胞中的整合 王晓萌１ꎬ周慧敏１ꎬ董奕彤１ꎬ陈胜男１ꎬ安铁洙１ꎬ殷萍２ꎬ王春生１∗ (１.东北林业大学生命科学学院ꎬ哈尔滨㊀１５００４０ꎻ２.黑龙江省医院ꎬ哈尔滨㊀１５００４０)㊀㊀ʌ摘要ɔ㊀目的㊀本研究拟构建肌肉特异表达Ｃａｓ９示踪同源打靶载体ꎬ为成肌细胞...
反应结束后,2μlDNaseI(M0303,NEB),37℃反应15分钟。 RNA提取(使用酚氯仿抽提小片段gRNA)。 1)加入80μlDEPC水,20μl3M醋酸钠(pH5.2)混匀后,加入等体积(200μl)的1:1苯酚/异戊醇混 北京唯尚立德生物科技有限公司 公司网站:.v-solid电话:***-***69订购邮箱:order@v-solid 合物...