三、CRISPR - Cas9系统的作用机制 （一）CRISPR - Cas9系统的组成部分 1. crRNA（CRISPR RNA）crRNA是CRISPR - Cas9系统中重要的RNA成分之一。它是由CRISPR基因座转录产生的，包含了与靶DNA序列互补的引导序列。这个引导序列决定了Cas9蛋白将在基因组中的哪个位置发挥作用。2. tracrRNA（trans - activating crRNA）t...
天然的CRISPR-Cas9系统由三部分组成:SpCas9 (以下简称Cas9)、crRNA、tracrRNA。其中,crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guide RNA),gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列。 为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性,Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier(2020年她们共同获得了诺贝尔化学奖)将crRNA和...
TracrRNA首次在转录后与Cas9蛋白结合;然后,pre-crRNA和tracrRNA之间的碱基互补配对形成双链RNA,并且pre-crRNA与Cas9结合。在结合发生后,RNaseIII在初级过程中构建pre-crRNA并且Cas9在次级过程中切割多余的重复序列和间隔序列。经过这两个过程后,crRNA成熟并获得靶向DNA...
gRNA (或称向导 RNA)是 CRISPR-Cas9 系统的一部分。gRNA 分子有两个组分:一个靶点特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一个辅助性的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过 20-mer crRNA 序列与靶基因组序列之间的碱基配对,引导Cas蛋白复合物对相应位点进行切割,决定编辑位点特异性。 什么是SgRNA? sgRNA 代表单向导 R...
其中,crRNA和tracrRNA通过局部碱基配对组成gRNA(guide RNA),gRNA与Cas9蛋白结合后引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA序列 (图1)。为了方便实验设计以及提高gRNA的稳定性,Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier将crRNA和tracrRNA融合成一条RNA [1],并把其称为sgRNA (single-guide RNA) (图2)。
tracrRNA-crRNA在被融合为单链向导RNA(sgRNA)时也可以发挥指导Cas9的作用。 CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过人工设计的 sgRNA(guide RNA)来识别目的基因组序列,并引导 Cas9 蛋白酶进行有效切割 DNA 双链,形成双链断裂,损伤后修复会造成基因敲除或敲入等,最终达到对基因组DNA 进行修饰的目的。
他们还阐明了CRISPR/Cas9的工作机制,指出Cas9的裂解位点由crRNA中的种子序列控制,并且需要PAM的参与。此外,通过改变种子序列的核苷酸序列,该系统可以在多种情况下发挥基因沉默的作用并通过改变核苷酸种子序列提供基因靶向和基因编辑的功能。 1.3 CRISPR技术的繁荣
CRISPR/Cas9系统可使用两种方式提供RNA引导序列,一种是使用合成sgRNA(single-guide RNA), 另一种是使用crRNA(CRISPR RNA)与tracrRNA(trans-activating RNA)双链体。这两种方法在gRNA的生成、结构、特异性等方面都有所不同。(1)使用合成sgRNA的方法可以直接将引导序
crRNA 是因为 CRISPR 序列跟之前获取的外源 DNA 片段相匹配才形成的，而转录启动子序列能给出一个能被 RNA 聚合酶识别的引导序列。sgRNA 和 Cas9 蛋白质组成复合物以后，会一起在目标 DNA 序列那里定位。sgRNA 依靠碱基互补配对，把 Cas9 蛋白质领到特定的 DNA 位置上。Cas9 蛋白质所具有的切割作用 一旦 Cas9 ...
一个经典的CRISPR/Cas9基因座包含cas基因与CRISPR重复间隔序列:cas基因编码参与CRISPR途径不同阶段的Cas蛋白;重复间隔区包含多个短而保守的重复序列区和多个俘获的外源DNA组成的spacer区,编码一种称为crRNA(CRISPR RNA)的分子,它能引导Cas蛋白在外源DNA中找到互补的核苷...