一、sgRNA的设计原则 1、特异性：确保sgRNA是特异性的，以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域，特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。2、GC含量均衡：sgRNA的GC含量应该在40-60%之间，以确保在实验条件下有适当的稳定性和杂交性。3、避免多个剪切位点：选择只有一个目标剪切位点...
一、实验前准备 材料和试剂 载体质粒:选择兼容Cas9和sgRNA的载体(如PX459、pSpCas9(BB)-2A-Puro)。 sgRNA序列:根据目标基因设计sgRNA(使用在线工具如CRISPR Design Tool)。 引物合成:合成含sgRNA序列的正向和反向引物(需包含酶切位点,如BbsI)。 工具酶:限制性内切酶(如BbsI)、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶(高保真酶...
该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。 细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括非同源末端连接和同源重组,以实现基因组的精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。 一、sgRNA的设计原则 1、特异性:确保sgRNA是特异性的,以免在基因组中...
CRISPR-Cas9基因编辑技术就是通过单向导sgRNA识别目的基因组序列,引导Cas9核酸酶对基因组进行有效切割,形成DNA双链断裂,通过细胞自身修复机制实现基因敲除、敲入、突变等,达到基因编辑目的。由于CRISPR-Cas9技术靶向灵活、编辑效率高、操作简便等特点逐步被应用于基因改造、药物开发、遗传病治疗等方面。 △图1.CRISPR/Cas9...
基本工作原理涵盖了一系列分子事件,从CRISPR序列适应外源DNA片段,通过转录和加工生成成熟的CRISPR RNA(crRNA)或合成单导RNA(sgRNA),到sgRNA与Cas9蛋白的复合形成。 该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。 细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括...
1.设计sgRNA: 使用在线工具(如CRISPR Design Tool)针对基因X设计sgRNA序列。 合成sgRNA并验证其序列正确性。 2.构建编辑载体: 将sgRNA序列克隆到表达Cas9蛋白的质粒载体中。 通过细菌转化和质粒提取获得重组质粒。 3.细胞培养和转染: 培养癌细胞系(如HeLa细胞)。
使用SnapGene软件对基因序列信息进行分析,如下图所示,WNT10B基因一共包含4个外显子,其中粉色区域为信号肽所在序列,该序列在蛋白质翻译加工过程中会被切除,sgRNA设计时应避免此段序列,最左边的的外显子序列也不参与蛋白质的翻译,也应该避免采用此段序列,所以最佳的sgRNA靶向...
6、避免选择在基因组上匹配到多个位点的sgRNA,可通过sgRNA设计软件筛选出移码突变率高且脱靶位点较少的sgRNA。 7、构建T7/U6启动子驱动sgRNA表达载体时,需注意sgRNA的5'碱基最好为G,或者人为添加一个G来提高其转录效率。 8、若要引发移码突变,必须将sgRNA设计在CDS区域,最好靠近编码蛋白的N端,最理想的位置是位于...
CRISPR-Cas9系统基本工作原理涵盖了一系列分子事件,从CRISPR序列适应外源DNA片段,通过转录和加工生成成熟的CRISPR RNA(crRNA)或合成单导RNA(sgRNA),到sgRNA与Cas9蛋白的复合形成。 该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。
1.sgRNA设计 1.1设计原则 1） II型CRISPR系统（SpCas 9）的sgRNA 靶点一般为20nt 2）sgRNA序列的碱基组成：基因特异的sgRNA 模板序列位于PAM 序列前，PAM序列的特征为NGG (N可以为任意核苷酸)3）sgRNA的序列应避免以4个以上的T结尾，GC%含量为30%-70% 4）sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽...