慢病毒载体作为CAR转导T细胞的载体,是CAR-T细胞生产过程中的关键原料,对实现大规模生产、缩短生产周期具有重要意义。 01 慢病毒载体和CAR-T 慢病毒载体是一种源于人类免疫缺陷病毒(HIV)的基因载体。在构建慢病毒载体时,为了避免产生有复制能力的病毒,会把HIV-1基因组分装与不同的质粒中,再共转染细胞,获得只有一次...
已有学者报道含有质粒或者体内转录mRNA的NC。质粒DNA可通过与PBAE载体材料共价连接的核定位-微管相关信号肽 (NLS-MTAS) 定向到细胞核。当转座酶 (如PiggyBac) 的表达质粒与转基因质粒共传递时,后者可以整合到宿主细胞的染色质中。 在LNP中,mRNA通过静电...
最后,为了进一步提高安全性,将表达CAR分子的目的基因、rev基因、gag和pol基因及VSV-G基因分别用4个质粒携带,慢病毒包装只需把上述4个质粒共同转染到293T细胞中,三个质粒分别表达病毒复制组装需要的元件,病毒就这样在293T细胞中包装出来了。 ▲图5. 慢病毒载体包装过程 慢病毒包装质粒的生产 常用的慢病毒包装质粒生...
最后,为了进一步提高安全性,将表达CAR分子的目的基因、rev基因、gag和pol基因及VSV-G基因分别用4个质粒携带,慢病毒包装只需把上述4个质粒共同转染到293T细胞中,三个质粒分别表达病毒复制组装需要的元件,病毒就这样在293T细胞中包装出来了。 ▲图6. 慢病毒载体包装过程 3 慢病毒包装质粒的生产 常用的慢病毒包装质...
最终我们就可以获得只有一次感染能力而无复制能力的HIV-1载体颗粒，也就是人类免疫缺陷I型病毒。到目前为止，慢病毒载体的设计大约经历了以下几个阶段：❶ 两质粒系统 以HIV-1为骨架，将其中的反式作用蛋白基因序列去除，然后包装成为含有目标基因的重组质粒和能够反式提供病毒颗粒所需蛋白的包装质粒，共转染包装细胞...
非病毒载体主要以转座子为代表,这也是目前的研发热点之一,转座子基因载体由一个携带CAR(转座子)的质粒和一个携带转座子酶的质粒组成,质粒经电穿孔进入T细胞,转座酶被表达后作用于CAR侧翼的末端导致重复序列,导致在T细胞基因组的TA二核苷酸序列上进行切除...
1. FectoVIR®-LV可提高慢病毒载体的生产力 在HEK-293和衍生细胞中,使用第三代质粒系统生产用于细胞和基因治疗的慢病毒载体。根据最佳滴度选择转染试剂是过程经济和强化的必要条件。与其他市售慢病毒特异性转染试剂相比,FectoVIR®-LV的功能滴度提高了3倍。
包装系统进一步升级,由四个质粒组成。此系统将原来的一个包装质粒分成两个质粒:一个编码 rev基因 ,另一个编码 gag 和 pol基因,包装质粒与任何表达慢病毒载体没有显著同源性,最大程度减少三个基因同时整合的可能性。通过将转移质粒 5'LTR 的 U3 启动子区替换为来自 CMV 或 RSV 的强病毒启动子构建 tat 非依赖...
❸四质粒系统 与三质粒系统相比,第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上;第二个变化是将tat基因去除,并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR,以启动载体质粒的表达,虽然更安全,但滴度不如三质粒系统高,目前部分实验室在用。 通常,三质粒系统能够兼容四质粒系统的transfer质粒,反之则不可以。
与三质粒系统相比,第一个变化是将rev基因放在一个单独的表达质粒上;第二个变化是将tat基因去除,并在载体质粒上增添了与异源启动子融合的嵌合5'LTR,以启动载体质粒的表达,虽然更安全,但滴度不如三质粒系统高,目前部分实验室在用。 通常,三质粒系统能够兼容四质粒系统的transfer质粒,反之则不可以。