三、美格生物邻近蛋白标记BioID技术与其他研究蛋白相互作用技术比较 传统的蛋白质互作研究技术比如酵母双杂交(Yeast-two-hybrid)缺乏与哺乳动物细胞类似的翻译后修饰系统,而且依赖高质量的cDNA文库;免疫沉淀联合质谱分析(Immunoprecipitation-Mass spectrometry,MS)受限于抗体的质量,而且难于保存蛋白互作的空间定位信息,不能捕...
通过基于质谱 (MS) 的蛋白质组学和高通量测序对纯化的蛋白质、RNA 和 DNA复合物进行鉴定和分析,分别用于研究天然顺式调节蛋白、RNA和远程DNA相互作用。 作者采用了经过验证的端粒靶向sgRNA(sgTelomere;图1C),它显示了dCas9-EGFP融合蛋白对端粒的特异性标记,与非靶向 dCas9-EGFP的弥漫性核仁定位形成对比(图1D)。
通过基于质谱 (MS) 的蛋白质组学和高通量测序对纯化的蛋白质、RNA 和 DNA复合物进行鉴定和分析,分别用于研究天然顺式调节蛋白、RNA和远程DNA相互作用。 作者采用了经过验证的端粒靶向sgRNA(sgTelomere;图1C),它显示了dCas9-EGFP融合蛋白对端粒的特异性标记,与非靶向 dCas9-EGFP的弥漫性核仁定位形成对比(图1D)。
之后,将样品保存在-20°C直到分析。 3.5 将生物素洗脱后的蛋白样品与SDS-PAGE蛋白质上样缓冲液混合,然后进行Western blot或液相色谱-质谱(LC-MS)分析。此外,蛋白质也可以在溶液中进行消化处理。 可选步骤:为了提高SDS-PAGE分析的蛋白质浓度...
传统的蛋白质互作研究技术比如酵母双杂交(Yeast-two-hybrid)缺乏与哺乳动物细胞类似的翻译后修饰系统,而且依赖高质量的cDNA文库;免疫沉淀联合质谱分析(Immunoprecipitation-Mass spectrometry,MS)受限于抗体的质量,而且难于保存蛋白互作的空间定位信息,不能捕获较弱或瞬时的相互作用。
同学们,上次给大家介绍了筛选型蛋白互作的研究方法2--TAP-MS的实验原理和流程,这次介绍的是方法3--BioID。 实验原理:BioID的基本原理是将生物素连接酶和诱饵蛋白在目的细胞中融合表达,加入适量的生物素后,与…
在ATP和生物素(Biotin)存在的条件下,BioID2融合蛋白能够对其半径内(根据是否保留linker,半径可为10nm或35nm)无论是直接相互作用的蛋白还是邻近的蛋白任意暴露在外的赖氨酸残基进行生物素标记。后续可通过Streptavidin磁珠或凝胶从细胞裂解液中分离纯化生物素标记蛋白,并通过质谱(MS)鉴定相互作用的蛋白。
Tandem MS was performed by isolation at 1.6 m/z with the quadrupole, higher energy collisional dissociation fragmentation with normalized collision energy of 32, and rapid scan MS analysis in the ion trap. The MS2 ion count target was set to 1 × 104 and the max injection time was ...
58% (11/19) of prey proteins uniquely associated with HopF2-BirA*, were present in the previously published AP-MS dataset, whereas less than 7% (6/91) of preys unique to BirA* were present in the AP-MS dataset18 (Table 1; Supplementary Table 1). HopF2-BirA* BioID identified ...
To identify biotinylated proteins, we used tandem mass spectrometry (MS/MS) and identified 3771 protein matches within the BirA-claudin-18 sample. Proteins of interest were vetted, and a list of protein candidates were compiled based on peptide spectrum matches (PS...