腺病毒(AAV)载体大规模纯化工艺 引言 腺病毒载体疫苗背景介绍 腺病毒是一种无包膜的双链 DNA 病毒,可以作为基因递送载体应用于疫苗研发,具有宿主范围广、对人致病性低、无插入致突变性、可激活天然免疫、能激活较高水平的体液免疫细胞免疫、在黏膜处即可进行免疫等,因此...
图2:病毒载体的生产工艺 在AAV的纯化过程中,面临一些挑战。如存在超过100种不同的变体AAV衣壳,而不同血清型的AAV蛋白存在差异,因此各种血清型的表面特性增加AAV纯化难度;针对工艺和产品相关的杂质(包括宿主细胞物质,DNA和空衣壳),缺乏一个有效和可重复的平台方法来将完整衣壳与空衣壳分离;另外,空衣壳的清除是一个...
采用表面活性剂TritonX-100作为细胞裂解的方法在AAV病毒载体纯化过程有较多的采用,这种方法很容易应用于AAV的规模化生产中,但根据最近的研究显示,TritonX-100处理过的病毒制品会导致一些诸如导致眼睛损伤、口腔毒性及皮肤刺激等生理毒性,随之被欧洲化学机构列为需高度关注的物质(SVHC)。因此,针对AAV工艺中的细胞裂解过程...
综合AVV制备的三个工艺阶段介绍,可以看出下游处理可以占病毒生产总成本的很大一部分,而且难度也是非常大,尤其是纯化过程。原因之一是由于有超过100种不同的变体AAV衣壳,不同血清型的AAV蛋白存在差异。因此,各种血清型的表面特性增加AAV纯化难度。原因之二是:针对工艺和产品相关的杂质(包括宿主细胞物质,DNA和空衣壳),...
AAV的生产通常使用三个单独的质粒进行病毒生产。然后,通过化学或机械裂解生产细胞并用核酸酶处理去除任何游离DNA来收集病毒后,将瞬时转染的细胞生产病毒数天。然后将细胞裂解物移至下游过程以进行病毒纯化。 每种病毒的工艺开发都有其独特的挑战,AAV也不例外。将病毒与工艺和产品相关的杂质分离(如细胞裂解后留下的...
AAV的生产通常使用三个单独的质粒进行病毒生产。然后,通过化学或机械裂解生产细胞并用核酸酶处理去除任何游离DNA来收集病毒后,将瞬时转染的细胞生产病毒数天[4,8]。然后将细胞裂解物移至下游过程以进行病毒纯化。 每种病毒的工艺开发都有其独特的挑战,AAV也不例外。将病毒与工艺和产品相关的杂质分离(如细胞裂解后留...
AAV的生产通常使用三个单独的质粒进行病毒生产。然后,通过化学或机械裂解生产细胞并用核酸酶处理去除任何游离DNA来收集病毒后,将瞬时转染的细胞生产病毒数天[4,8]。然后将细胞裂解物移至下游过程以进行病毒纯化。 每种病毒的工艺开发都有其独特的挑战,AAV也不例外。将病毒与工艺和产品相关的杂质分离(如细胞裂解后留...
综合AVV制备的三个工艺阶段介绍,可以看出下游处理可以占病毒生产总成本的很大一部分,而且难度也是非常大,尤其是纯化过程。原因之一是由于有超过100种不同的变体AAV衣壳,不同血清型的AAV蛋白存在差异。因此,各种血清型的表面特性增加AAV纯化难度。原因之二是:针对工艺和产品相关的杂质(包括宿主细胞物质,DNA和空衣壳),...
整个AAV载体制备的工艺流程可以大致分为3个部分:上游培养、下游纯化和成品包装。其中上游培养和下游纯化中,涉及了更多的生产步骤、技术更加复杂,这里我们将做重点探讨。 一、上游培养: AAV上游培养主要包括4个步骤:①质粒的生产制备;②产病毒细胞的扩增;③质粒的转染;④发酵产病毒。