1、准备好3AT的粉末和无菌水。2、根据需要的浓度计算所需的3AT粉末量，将其称量到无菌管中。3、加入适量的无菌水，使3AT完全溶解。4、过滤灭菌，得到3AT溶液。5、将3AT溶液加入含有His标签的蛋白质表达菌株的培养基中，最终浓度一般为0.5-10mM。3AT是一种常用的选择性抑制剂，可以抑制带有His标签...
含有HIS3报告基因,可以使用3-AT调节筛选严谨度的酵母菌株:AH109,Y187(含有pHIS2质粒),Y2HGold,Y190,NMY51等。 注意事项 1. 2M 3-AT溶液浓度偏高,温度降低时可能会有沉淀析出,将3-AT溶液放37℃预热可重新溶解,也可剧烈摇晃促进溶解。 2. 不开封的2M 3-AT溶液可在-20℃保存2年,开封后若发现染菌,停止使用。
3.灭菌筛选培养基,待培养基冷却到55 ℃左右,加入3-AT母液,摇匀后倒板; 4.标记每个平板的3-AT浓度,超净台冷却凝胶后,按单位面积单个克隆计算培养物浓度,涂板; 5.28-30 ℃培养3-5天,筛选出最佳3-AT浓度,用于后期互做筛选。 储存条件: 1.理想情况10 mM浓度的3-AT平板会有少量生长,20 mM浓度的3-AT不能...
0~100mM一般Y2H双杂体系中不存在泄露表达，使用3-AT情况较少，AH109同理。 常规自激活检测不会进行3-AT浓度抑制检测，存在自激活情况时才会进行3-AT浓度抑制检测。 ③单杂Y187体系，一般都会有泄露表达和自激活情况，需要0~100mM的3-AT梯度检测。
设置 3-AT 的浓度梯度(建议设置 10-50mM 的浓度梯度,常见浓度约 30mM ); 3. 灭菌筛选培养基,待培养基冷却到 55℃左右,加入 3-AT 母液,摇匀后倒板; 4. 标记每个平板的 3-AT 浓度,超净台冷却凝固后,将转化或培养物涂板; 5. 28-30℃培养 3-5 天. 注意: 理想情况 10mM 浓度的 3-AT 平板会有...
加入的 3-AT 浓度过高,蛋白间比较弱的相互作用也可能被抑制,因此需要筛选3-AT 的最适浓度。自激活检测:将含有诱饵蛋白的酵母菌,分别图板单缺培养基以及含 10-80 mM 3-AT 的二缺(单缺-His)培养基上。30℃培养。理想情况 10mM 浓度的 3-AT 平板会有少量生长,20mM 浓度的 3-AT 不能或极少生长。如在...
请问大家在做酵母单杂交，检测启动子自激活时，3-AT浓度最高可以设置到多少呀？我用的是pHIS2和pGADT...
报告基因时,会有一定程度的泄漏表达,出现背景过高的现象,这时可以在筛选培养基中加 入适量的 HIS3 蛋白竞争性抑制剂 3-AT(3-amino-1,2,4-triazole),以降低背景;或者增加一个筛选标记 Ade 来进行更加严格的筛选.加入的 3-AT 浓度过高,蛋白间比较弱的相互作用也可能被抑制,因此需要筛选 3-AT 的最适浓度. ...
最终以能抑制细胞生长的最低3-AT浓度作为最佳筛选浓度,大部分情况使用25mM。【文献来源:Modified Yeast-Two-Hybrid System to Identify Proteins Interacting with the Growth Factor Progranulin.PMID: 22297851】 Bai Ming-Yi等MKBIO发现携带pGALBD–OsBZR1S156G质粒的酵母菌在含2mM 3-AT的SD−Trp/−His上生长...
3-AT溶液为经过过滤除菌的即用型母液,用于酵母杂交实验抑制本底表达,用以准确筛选出蛋白互作引发的His的报告基因的表达。 使用方法: 1.计算所需平板的数量,计算配置培养基体积; 2.设置3-AT的浓度梯度(建议10-50 mM 的浓度范围设3-5个梯度,常用浓度约30 mM); ...