UMI:(Unique Molecular Identifiers)是短序列,用于唯一标记样品库中的每个分子。UMI被广泛用于测序应用,大多关于DNA和cDNA的PCR重复。UMI去重复还可用于RNA-seq基因表达分析和其他定量测序方法。简而言之:UMI是唯一可识别的短序列,作为UMI是唯一的,所以我们可以知道在PCR扩增的过程中哪些是由同一条DNA扩增出来的。 基...
Oligo dT序列(图中第一条)由4个部分组成:read1用于上机测序;第二段是16bp 的10x barcode序列,每一个Gel Beads都携带不同的barcode , 可标记获取的mRNA都来自于哪一个细胞;第三段UMI长度为12bp, 可以将转录本序列进行绝对定量,避免扩增产生偏好;第四段是30bp的ployT,用于捕获有ployA尾的转录本。 捕获和建库...
UMI。UMI 全称「unique multiplex index」,是一段 10nt 的随机序列,有百万级序列的变化()。顾名思义,每个 DNA 分子都将有自己的 UMI 序列,使得在经过 PCR、测序后得到的多个 reads,仍能兼并到原始的 cDNA 分子,从而排除各种 cDNA 序列因为 PCR 效率...
通常每个beads拥有一组不同的UMI。 Poly(dT)VN:与mRNA的PloyA尾互补,用来捕获细胞内,。 CB即cell barcode, 不同版本CB与UMI的长度变化。 10×genomics单细胞分选 该平台的单细胞分离技术是基于微滴的微流体。它允许水滴在连续油相中单分散。 GEM会从左往右流动,在第一个十字路口,样本细胞会进入和凝胶珠结合,...
一般一个细胞可以得到40000~80000个有效的UMI,平均一个细胞的一个基因有10个左右的UMI。 注意:一般情况下,大部分的细胞是一个细胞有一个Barcode。少量情况,两个或更多数量的细胞共享一个barcode,因此,在做细胞混悬液的时候,要控制原始的细胞数。一个样本混悬液当中的细胞数控制在1万以下为好。
首先,1-26个cycle就是测序得到了26个碱基,先是16个Barcode碱基,然后是10个UMI碱基;这个文件就是R1了,但是它有可能也是在100bp或者150bp里面,因为测序仪就是这样的规格,只能说浪费掉。。。 然后,27-34这8个cycle得到了8个碱基,就是i7的sample index;这个文件可有可无,就不关心它了。 最后...
每个V(D)J链捕获1到几个umi。一轮以C-region5 '端为靶点的富集PCR反应,接着是酶的裂解反应,结果产生了来自同一转录本的分子池(pool of molecules )。分子携带相同的10x条形码和UMI序列,但插入长度不同,导致R2起始点不同。R2起始点的多样性使每个转录本的目标部分得到完全覆盖,一般约为650bp。
基于10X Genomics 平台的高通量单细胞 RNA Seq技术是利用液滴法的原理,使用GemCode技术,通过控制微流体的进入,将带有 barcode、UMI(Unique Molecular Index,分子标签)、引物及酶的凝胶珠(Gel Beads)与单细胞混合,从而实现大规模的单细胞分离,以及单细胞文库构建的技术。 图1 10X Genomics 技术原理示意图 10X Genomics...
默认情况下,丢弃那些低对齐质量的读取,包括MAPQ < 20,对齐长度< 30 nt和FLAG与UNMAP, SECONDARY, QCFAIL(和DUP,如果UMI不适用)。然后,对于基于液滴的样本(模式1a或2a),我们通过哈希图将所有这些读取分配到每个细胞中,或者对于well-based的细胞(模式1b或2b)直接分配。在每个cell中,计算所有A, C, G, T, N...