冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在 37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。 2、超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定好超声时间和间...
经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和 SDS裂解法等。 (一)碱裂解法 在NaOH 存在的强碱性(pH 值 12.0~12.6)条件下,SDS 破坏细胞壁并裂解细胞,同时使宿主细胞的蛋白质及染色体 DNA 发生变性,而质粒 DNA 由于其分子量小且缠结紧密不易变性,只要不在碱性条件下存在太久,可在 pH 值调至中性时,恢 复其天然构象...
上清夜快速置于冰上备用,沉淀用于进一步裂解。将上述沉淀悬浮于0.2ml提取缓冲液中,旋涡10min,加入溶菌酶(100ml/l)50ul,轻轻混匀后,37C温浴30min,再加入250ul SDS 缓冲液(100 mmol/l Tris-HCl, 200 mmol/l NaCl,2.0% SDS, PH8.0),上下颠倒10min,13000 r/min离心10min,收集上清夜。 二、DNA纯化 葡聚...
加入1X SDS 样品缓冲液(6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径的平板 500 µl)来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。 超声处理 10–15 秒以完成细胞裂解并剪切 DNA(以降低样品粘度)。 取20 µl 样品,在 95–100°C 下加热 5 分钟;放在冰上冷却。
简而言之,用胰蛋白酶消化收获培养的细胞并用RIPA裂解缓冲液(25mM Tris–HCl pH7.6,150mM NaCl,1%NP-40,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS)裂解以提取总蛋白。每个Western样品含有30微克总蛋白,该蛋白在上样缓冲液(50mM Tris HCl,pH6.8,2%SDS,6%甘油,2mM DTT,0.01%溴酚蓝)中通过在95℃加热5分钟变性,然后用变性蛋白电泳...
取对数生长期细胞,每孔5×104个接种于6孔板中,待细胞融合至80%时,加入含药物的无血清培养基(组别设置同“2.7”项),48 h后,加入每孔100 μL的RIPA裂解液,冰上裂解30 min,于4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min,提取全蛋白。BCA法...
SDS-PAGE电泳 转膜 封闭 抗体孵育 检测和显影 PART TWO 样品准备 - Sample Preparation - 1 原理 >> 细胞或组织中，蛋白质被多种成分（脂质、核酸、糖类等）包裹，需通过裂解和变性将其提取出来并保持稳定性。2 操作与解析 >> 裂解：使用RIPA裂解液等去污剂溶解细胞膜，释放蛋白质。同时加入蛋白酶和磷酸酶抑制...
5.酚-氯仿抽提法是目前基因组DNA提取的经典方法。 6.质粒DNA的提取方法主要有碱裂解法、煮沸裂解法、SDS裂解法。 7.核酸的最大紫外吸收波长在260nm,蛋白质的最大吸收波长在280nm,盐和小分子的最大吸收波长在230nm。 8.影响DNA复性的因素有DNA浓度、DNA分子量、温度和碱基组成。
③裂解完成的样品在4℃下14000g离心15min。 ④上清液即为总蛋白样本,样本如暂不进行后续实验需放在-80℃储存。 ⑤使用蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。 注意事项:为了避免蛋白质的降解,蛋白提取操作过程应尽量保持低温。 03、SDS-PAGE凝胶电泳 Western Blot的第二步为电泳,进行电泳是为了将蛋白质按不同分子量大小...
可以直接用于细胞或组织样品的裂解,并用于后续常规的SDS-PAGE蛋白样品的上样。使用1×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液直接裂解蛋白样品的优点是比较便捷;缺点是裂解好的蛋白样品不能用常规的Bradford法或BCA法测定蛋白浓度。这样蛋白上样量的均一性就较难控制,需要借助考马斯亮蓝等的染色结果或Western的检测结果,来调整上样...