冷冻通常在液氮或-20°C冰上进行,解冻可以在 37、50、65 或100℃水浴中进热休克比化学裂解温和,但是很有效,有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。 2、超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法,把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂,所以加热不宜过剧烈,要设定
经典的方法包括碱裂解法、煮沸裂解法和 SDS裂解法等。 (一)碱裂解法 在NaOH 存在的强碱性(pH 值 12.0~12.6)条件下,SDS 破坏细胞壁并裂解细胞,同时使宿主细胞的蛋白质及染色体 DNA 发生变性,而质粒 DNA 由于其分子量小且缠结紧密不易变性,只要不在碱性条件下存在太久,可在 pH 值调至中性时,恢 复其天然构象...
使用RIPA裂解液等去污剂溶解细胞膜，释放蛋白质。同时加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，避免降解或去磷酸化。冰浴操作减少蛋白降解。离心：将裂解液超速离心，去除不溶性碎片和细胞核，收集上清液（含目标蛋白）。定量：通过BCA或Bradford法测定蛋白浓度，确保每个样品上样量一致。原理：（1）BCA：基于双缩脲原理，碱性条件下...
1.在室温或不超过37℃的水浴中溶解SDS-PAGE上样缓冲液(1X)。水浴溶解后立即室温存放，尽量避免长时间置于水浴中。2.对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6 孔板每孔加入150-250微升SDS-PAGE上样缓冲液(1X)的比例加入裂解液。用枪吹打数...
近来还发现1,3-丙二醇还可以用于热塑性塑料、涂料和胶片的制造,如用1,3-丙二醇合成的热塑性聚氨酯(tpu),改善了热水解性和热稳定性。 1,3-丙二醇合成方法主要分为化学合成法和微生物合成法,化学法主要有环氧乙烷羰基化法和丙烯醛水合氢化法。目前通用的微生物法生产1,3-丙二醇主要是利用微生物将甘油转化为1,3-...
建议使用裂解效果强的RIPA裂解液或者SDS裂解液,保证可以裂解核膜。裂解完增加超声步骤,完全破碎细胞膜和细胞核膜,打断DNA,充分释放蛋白,同时可以增加样本的均一性。建议每次超5～10S,间隔20S,共三个循环。超声时需要根样本体积及所用的探头大小调整超声功率,尽量保证在超声过程中样本不起泡,超声后样本变得澄清。
转染后24小时,在B-缓冲液(150 mM NaCl,10mM Tris-HCl,pH 7.4,1 mM EDTA,pH 8.0,1% SDS)中裂解细胞。使用牛血清白蛋白校准曲线,通过蛋白质样品与考马斯蓝染料反应后在595 nm处的吸光度测定蛋白质浓度(Bradford法)。在100℃下...
取等量的蛋白样品上样,通过SDS-PAGE凝胶电泳后转膜,将PVDF膜放入5%脱脂牛奶室温下封闭1 h。TBST洗膜2 min×3次后,分别加入GAPDH一抗(1∶10 000)、HMGB1一抗(1∶10 000)、HSF1一抗(1∶30 000)(Abcam公司,美国)4 ℃孵育过夜...
③裂解完成的样品在4℃下14000g离心15min。 ④上清液即为总蛋白样本,样本如暂不进行后续实验需放在-80℃储存。 ⑤使用蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定。 注意事项:为了避免蛋白质的降解,蛋白提取操作过程应尽量保持低温。 03、SDS-PAGE凝胶电泳 Western Blot的第二步为电泳,进行电泳是为了将蛋白质按不同分子量大小...