📝 实验步骤 连接反应:将外源 DNA 片段与载体 DNA 在连接酶的作用下进行连接。 转化:将连接后的 DNA 溶液转入宿主菌中,通过热激或电击等方法进行转化。 筛选:通过抗性筛选或蓝白斑筛选等手段,筛选出成功重组的质粒。📊 数据分析 对筛选出的质粒进行进一步鉴定,如酶切鉴定或测序,确保重组质粒的正确性。通过以上...
二、 E. coli DH5α 感受态细胞的制备及转化 每组连接反应混和物各取 2μl 转化 E. coli DH5α 感受态细胞。具体方法见第三章。 三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取 100μl 用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养 半小时以上,直至液体被完全吸收。 2、倒置平板于 37℃继续培养 12-16...
用特定的限制性内切酶切割载体DNA和外源DNA片段并进行纯化,于体外使两者相连接(若用T-载体,可直接用纯化的PCR产物进行连接),转化宿主细菌后,利用蓝白斑筛选原理对重组子进行挑选。由于载体上带有Amp'和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补原理筛选相结合的方法。 初步的抗性筛选:载体上带有Amp'基因而外...
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整...
每组连接反应混和物各取2μl转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。 三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。 2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
重组质粒的连接、转化及筛选 概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作...
重组质粒的连接、转化及筛选 1概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际...
变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒 DNA 为 pBS,转化受体菌为 E. coli DH5α 菌株。由于 pBS 上 带有Ampr 和 lacZ 基因,故重组子的筛选采用 Amp 抗性筛选与 α-互补现象筛选相结合的 方法。 因pBS 带有 Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有 pBS DNA ...
三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。 2、倒置平板于37℃继续培养12-16小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。 3、放于4℃数小时,使显色完全(此步LB培养基不做)。
实验四重组质粒的连接、转化及筛选【实验材料】外源DNA片段:自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知;载体DNA:pBS质粒(Ampr,lacZ),自行提取纯化,浓度已..