📝 实验步骤 连接反应:将外源 DNA 片段与载体 DNA 在连接酶的作用下进行连接。 转化:将连接后的 DNA 溶液转入宿主菌中,通过热激或电击等方法进行转化。 筛选:通过抗性筛选或蓝白斑筛选等手段,筛选出成功重组的质粒。📊 数据分析 对筛选出的质粒进行进一步鉴定,如酶切鉴定或测序,确保重组质粒的正确性。通过以上...
用特定的限制性内切酶切割载体DNA和外源DNA片段并进行纯化,于体外使两者相连接(若用T-载体,可直接用纯化的PCR产物进行连接),转化宿主细菌后,利用蓝白斑筛选原理对重组子进行挑选。由于载体上带有Amp'和lacZ基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补原理筛选相结合的方法。 初步的抗性筛选:载体上带有Amp'基因而外...
在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源 DNA 的重组质粒和无插入而自 身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源 DNA 片段和载体 DNA 的浓度比例,...
8、在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上,携带载体DNA的转化子为蓝色菌落,而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可使显色反应充分,蓝色菌落明显。
二、 E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化 每组连接反应混和物各取2μl转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。 三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全...
重组质粒的连接、转化及筛选1带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端这也是最容易克隆的dna片段一般情况下常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点因而几乎总能找到与外源dna片段末端匹配的限制酶切位点的载体从而将外源片段定向地克隆到载体上 重组质粒...
重组质粒的连接、转化及筛选 1概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(<10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的,先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际...
三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半...
质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组子的筛选鉴定 陈倩倩交流生118627140313 一、实验目的: 1、学习和掌握限制性内切酶的特性 2、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 3、掌握利用CaCl2制备感受态细胞的方法 4、学习和掌握热击法转化E.coli的原理和方法 5、掌握α互补筛选法的原理 6、学习用试剂盒...
质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组⼦的筛选鉴定 分⼦⽣物学实验 质粒DNA及λDNA的酶切、连接、转化及重组⼦的筛选鉴定 郭森 200900140029 基地第4组（同组：付伟伟、葛纪弯）⽣命科学学院 2009级⽣命技术基地 ⼀、实验⽬的 1、学习在实现DNA的体外重组过程中，如何正确选择合适的载体和限制性...