PCR的退火时间要把握严格，太长的话会导致变性的DNA两条链重新连接，影响下面的延伸过程；如果时间过短的话，会导致引物没有与DNA链完全连接，导致延伸失败或复制错配
时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在 AT(退火温度）.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险
其实PCR的退火温度和时间是根据你的引物和目的片段大小而定的。。这个还真没有试过，你可以尝试一下。
检查引物和探针的 Tm 值, SYBRGreenI 的退火时间大约 20 到 35秒, 双标记探针通常是两步法,退火和延伸合并为一步,时间大约是45到60秒,温度通常在60C, 对手FRET 探针退火步骤大约20到30秒。
杂带会增加
大部分的双链DNA在950C就开始解链了,在有些情况下在90至94C都不能很好地变性 DNA.由于部分变性, 参加反应的探针和引物相应的减少了,因此反应效率会下降.15到20秒对于变性扩增子是足够了, 然而, 长一点的产物, 可能会需要 30秒,60秒的变性时间通常是不需要的。