使用20ml无菌注射器,吸取细胞上清,然后重新加入全培6ml左右,重新放回培育箱,等到72h的时候再收一波病毒。 提前准备好0.22um的滤嘴(笔者使用的是biosharp 便宜又好用)将病毒液进行过滤,注意,使用期间可能出现滤芯阻塞导致无法推过去的情况,请及时更换滤芯,不要强用力将液体过滤,因为会损伤病毒。慢慢将病毒液推过滤器,...
过表达慢病毒构建及包装 慢病毒包装 1 、特点: 1.1 直接包装成为假病毒颗粒,对分裂和非分裂细胞均有感染作用,适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞 (比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。 1.2 可以通过简单方式,在短时间内获得稳定表达特定基因的多种细胞株。
1、慢病毒过表达质粒载体的构建 设计上下游特异性扩增引物,同时引入酶切位点,PCR(采用高保真KOD酶,3K内突变率为0%)从模板中(CDNA质粒或者文库)调取目的基因CDS区(coding sequence)连入T载体。将CDS区从T载体上切下,装入慢病毒过表达质粒载体。 2、慢病毒干扰质粒载体的构建 ...
1、Cas9蛋白的基因长4kb,Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低,推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。 2、Cas9基因较大,包装时产生的空壳病毒(即有病毒外壳,但没有组装进目的基因的病毒)比较多。感染细胞时,这些不正确的病毒会竞争细胞表面受体,造成正确病毒感染率下降。密度梯度离心能去除病毒空壳,因此采...
慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体,能同时感染分裂细胞和非分裂细胞,并且可以整合到细胞基因组中高效表达。对于一些较难转染的细胞,如原代细胞,干细胞,不分化的细胞等,使用慢病毒载体,能大大提高外源基因的转染效率。将重组病毒质粒及其辅助包装质粒系统共转染至包装细胞中,收集富含慢...
慢病毒(过表达)包装步骤以10cm培养皿为例最好在铺细胞后20h左右进行转染控制转染前细胞密度7090证细胞处于良好的状态转染前一小时把一半培养基约5mlpsin10ugpspax210ugpmd2g5ug800uloptimem加40ul慢病毒转染试剂于800uloptimem混匀室温静置5min边轻轻混匀室温放置20min取出细胞培养皿将得到的质粒转染试剂复合体...
病毒感染法是目前最常用的基因导入方式之一。通过对病毒基因组的遗传改造,使之携带外源目的基因,并被包装成病毒颗粒。病毒进而侵染宿主,使携带的外源基因在宿主体内表达。 常见的病毒表达系统有慢病毒、腺病毒等。慢病毒感染宿主细胞时,可将携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中,实现目的基因稳定、长期的表...
1、cas9蛋白的基因长4kb,cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低,推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。 2、cas9基因较大,包装时产生的空壳病毒(即有病毒外壳,但没有组装进目的基因的病毒)比较多。感染细胞时,这些不正确的病毒会竞争细胞表面受体,造成正确病毒感染率下降。密度梯度离心能去除病毒空壳,因此采...
如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整 Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤 概述: 以下采用Polyfect-V转染试剂为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书,也可以通过预实验决定。
Oct-4过表达慢病毒包装纯化实验 摘要:本实验使用四质粒包装系统获得高滴度的过表达human Oct-4基因的慢病毒颗粒。病毒滴度的检测使用qPCR定量检测慢病毒在细胞基因组中的整合拷贝数,能够严谨客观地反应慢病毒的感染和整合能力。该慢病毒系统中外源基因的表达框为pLenti–CMV- Oct-4-EGFP-3FLAG-PGK-Puro:CMV启动子驱...