1.2 qRT-PCR引物 qRT-PCR是特殊的PCR和应该报告基因的结合体,所以qRT-PCR的引物设计要满足一般PCR引物设计的原则,此外还有一些额外的规则。首选扩增子大小为75 - 150bp,但必要时可以使用更长的扩增子(更短的扩增子具有更高的PCR效率)。使用稍长的扩增子(150-200 bp),使我们能够验证分析),40-60% GC含量,Tm...
qrt引物设计原则 1.选择合适的引物长度:引物的长度应该在18-24个碱基对之间,过短的引物可能会导致引物与非特异性DNA结合,而过长的引物则可能会导致非特异性杂交。 2.避免引物的自身互补性:引物的5'端和3'端不应该互补,这会导致引物形成二聚体或发生自身杂交,从而影响PCR反应的特异性和效率。 3.避免引物与非...
qRT-PCR有自己的引物标准,简单而言,引物设计要用专门的软件,qpcr引物设计原则包括内参基因与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外,还需要注意以下法则: 1)用于突变体的基因表达量鉴定时,引物最好设在两个外显子之间,横跨中间的内含子,这样可以避免DNA的污染; 2)用...
引物设计原则: 选择高度保守,无复杂二级结构的模板序列。 引物长度通常为18-24 bp(或者是17-25 bp),Tm值通常为58-62℃(可以偏高一点),上下游引物Tm不能超过2℃,长度差不超过4bp,引物GC含量在40-60%之间。 引物设计跨两个外显子。 产物大小在100-200 bp,最长不得超过300bp...
2.1 qRT-PCR 引物设计原则 2.2 qRT-PCR 引物设计方法 如图所示,我们一般进行定量的方法都是SYBR Green ,里面也可以选择TagMan进行引物设计。 这里介绍的是Beacon Designer 软件设计引物的方法。 根据引物设计原则可以更高GC含量,引物长度,Tm值,产物长度等等。
qRT-PCR的引物设计需遵循一般PCR引物设计原则并结合额外规则。首选扩增子大小为75-150bp，更长的扩增子（150-200 bp）可验证分析。引物应具有40-60%的GC含量，Tm接近60°C，3'端以2G/C夹紧，避免单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸重复，且避免引物的同源和异源二聚化。同时，设计引物时需关注目标上的...
1. 上下游引物的长度一般为18-30bp之间,且Tm值在58-62℃之间,上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。 2. GC=30-80%; 3. 应避免引物中多个重复的碱基出现,尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3’端最好不为G或/和C。引物3’端的5个碱基不应出现2个G或/和C。 4. PCR扩增产物长度:引物的...
设计原则:(如果没得选,这些原则也可适当放宽) 获取基因fasta文件 在NCBI-PMC-Gene搜索框Home - Gene - NCBI里输入需要的基因,注意搜索框前面得选择Gene。选择所需要的基因片段,一般是NR开头,点击FASTA,可以得到一个FASTA文件。 网站上下载得到的文件 打开primer5,file→open→DNA sequence,选择刚刚下载的文件。
QRT-PCR引物设计概述：在QRT-PCR过程中，由于涉及到模板定量，所以要求引物特异性强，并且不能扩增出基因组DNA（如果用DNA酶处理干净另当别论），所以要求跨外显子设计（可以不用考虑基因组DNA污染），或跨内含子设计（检验DNA酶是否处理干净，即无基因组DNA污染）。下面是自己在设计过程的一些心得体会，与大家分享...