GST-pulldown技术主要用于研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用,可以验证两种已知的蛋白质可能存在的直接相互作用或者寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知靶蛋白,且体外验证蛋白直接相互作用时有较强的特异性。 GST pull-down的基本原理是将靶蛋白-GST 融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽琼脂糖磁珠上,作为与目的蛋白亲和...
IP和Co-IP通过固定抗体来捕获诱饵蛋白质及其结合分子,而pull-down可使用带亲和标签的目的蛋白进行,在体外验证蛋白间的直接相互作用。Pull-down是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的“诱饵”蛋白,从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获“猎物”蛋白,然后将复合物蛋白分...
孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA|Pansobin”，因为SPA|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。
经典的AP-MS实验通常包含以下4个关键步骤：1）细胞或组织的裂解；2）蛋白溶液与偶联抗体的亲和微珠的孵...
下拉实验（pull-down assay）是验证体外蛋白互作的主要方式，也是验证没有成熟抗体的蛋白互作的方式之一。通过体外表达亲和蛋白-GST，将亲和蛋白固化在谷胱甘肽亲和树脂上充当“诱饵蛋白”，将细胞或者组织的总蛋白和此“诱导蛋白”混合孵育后可从中捕获“目标蛋白”，最后通过洗脱的方式将“目标蛋白”洗脱后检测，就可以...
荧火素酶互补实验最初应用于哺乳动物细胞内蛋白质互作研究,后来用于检测植物蛋白质-蛋白质的相互作用。其实验原理是以荧火素 (luciferin) 为底物来检测荧火素酶 (luciferase) 的活性。具体而言,生物体来源的荧火素酶催化底物荧火素发生氧化,发出最强波长在560 nm左右的生物荧光 (bioluminescence)。
实验方法 1. 预清洗beads。 2. 取蛋白样品分成input,igG组和目标抗体组进行IP。 3. 取出预清洗的beads. 加入 IP用的目标抗体和igG在rotator进行IP反应过夜。 4. IP过夜后收取蛋白 5. 通过SDS-PAGE和Western Blot或质谱进行检测。 结果展示 实验周期及交付标准 ...
验证两个蛋白互作的实验方法 1. 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation),这是一种常用的方法,通过将一种蛋白的抗体与另一种蛋白结合,然后使用蛋白A/G琼脂糖或其他亲和层析介质来沉淀出这两种蛋白的复合物,最后通过Western blot等方法检测是否存在互作。 2. 酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid),这是一种体外的方法,利用酵母...
本文将介绍几种常用的蛋白互作实验方法。 1.免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation, Co-IP) 免疫共沉淀法是一种常用的检测蛋白互作的方法。其基本步骤为首先选择目标蛋白A,通过特异性抗体结合于固相支持上(如ProteinA/G琼脂糖),形成免疫寡聚体;然后用该寡聚体与细胞提取物混合,使抗体与目标蛋白A结合;接下来通过...
Pull-down是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的“诱饵”蛋白,从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获“猎物”蛋白,然后将复合物蛋白分离后进行凝胶或质谱分析,从而确认互作蛋白的 “身份”。Pull-down较Co-IP的优点在于,不仅能证实靶蛋白的直接相互作用,且洗脱条件也很温和,保留蛋白质结构与天然蛋白复合体的同时,又...