(4)4°C,12000rpm,离心15min,收集上清 (5)测定蛋白浓度,取1mg总蛋白做GST-Pull-down? (6)留30μl作为input对照(input与Pull-down蛋白量约为1/10) (7)其余溶液,加入20μl glutathione sepharose beads(PBS洗涤过),4°C,轻柔振荡20min (8)12000rpm,离心3min (9)收集上清,分为两份,一份加入1-15μg ...
SDS-PAGE分析:通过SDS-PAGE检测洗脱峰的纯度,确认NXT1蛋白的表达与纯 化效果。目标蛋白应出现在预期的分子量处(约22 kDa)。 进一步纯化:如果需要更高纯度,可使用离子交换层析(如Q Sepharose或DEAE 层析)或凝胶过滤层析进一步纯化NXT1蛋白。 4. 蛋白浓度测定与保存 浓度测定:使用Bradford法或紫外分光光度法测定纯化...
酶切:与去除酶孵育以去除His-tag。 二次层析:通过亲和层析或其他方法进一步纯化,去除去除酶和标签。 2.4 纯化蛋白质的检测 SDS-PAGE:用SDS-PAGE分析纯化蛋白的纯度和分子量。 Western blot:使用抗体验证PSG2蛋白的存在和特异性。 蛋白质浓度测定:使用BCA法或Bradford法测定纯化蛋白的浓度。 3. 蛋白质保存 分装:将...
(3)纯化PDK1蛋白: a. 收集表达PDK1的细胞,进行裂解并使用超声波处理; b. 以亲和层析柱(如Nickel-Sepharose柱)作为初步纯化步骤,根据His-tag进行分离和捕获; c. 进行柱洗脱,使用合适的缓冲溶液(如含有His-Tag的Elution Buffer)洗脱目标蛋白; d. 纯化后的PDK1蛋白进行浓缩和储存。 实验标题:PDK1蛋白的表达和纯化:...
如果您的目的蛋白不需要重复出现,另一种方法是在昆虫细胞系中瞬时表达。在昆虫细胞系中瞬时表达的过程类似于 在哺乳动物细胞系中 基于脂质体的转染。通常用于瞬时表达的载体是 pBiex。与杆状病毒类似,瞬时表达也会导致高蛋白表达水平。细胞应以 2×10 6转染 密度,可在 72 小时后收获用于裂解和蛋白质纯化。
DAP-Seq(DNA亲和纯化测序) | 传统的ChIP-seq 是进行体内检测 TFBS 的主要方法,繁琐步骤和材料需求阻拦了很多科研进程。DNA亲和纯化测序方法,成功将体内结合实验转移到体外,解决了ChIP抗体制备的困扰,极大的提高 DNA Binding Site发现的效率。 DAP-seq不仅能够超高通量查找TFBS,还能深入了解众多TF的生物学特性和结合位...
GST表达融合蛋白 pGEX-KG 大小:5006bp,氨苄青霉素抗性(Ampr),IPTG诱导表达 酶切位点:BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994 GST分子量: 构建pGEX-KG-YFG重组 质粒 1、分析所感兴趣的基因(your favorite gene, YFG) ...
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 (1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根) (2)2 ml离心管中,加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng),混匀(质粒≤感受态1/10) (3)冰上放置30min (4)42°C,90s (5)冰上放置2-3min (6)加入300μl LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB),37°...
7、转化BL21(DE3)pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达 (1)冰上融化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(天根) (2)2 ml离心管中,加入25μl BL21+ 3μl质粒(300-500ng),混匀(质粒≤感受态1/10) (3)冰上放置30min (4)42°C,90s (5)冰上放置2-3min (6)加入300μl LB(无抗生素)(相当于菌体10倍体积的LB),37°...