一、菌落PCR实验步骤 1、准备工作:无菌1.5ml EP管、1ml移液枪及枪头、200ul移液枪及枪头、10ul的枪头、含氨苄青霉素抗性(Amp)的LB固体培养基、含Amp抗性的LB液体培养基、封口膜、无菌水、200ul PCR管等。 (1)分别标记200ul PCR管和1.5ml EP管;并分别在200ul PCR管中加入8ul的无菌水,在1.5ml的EP管中...
1️⃣ 单菌落挑取:在培养皿外做标记。 2️⃣ 菌落PCR反应:配置PCR溶液体系,设置PCR仪器。 3️⃣ DNA电泳检测:判断阳性克隆并测序(注意保种)。🔧 菌落PCR具体操作: 1️⃣ 挑斑:在超净工作台挑取长斑。 2️⃣ 准备培养基和PCR管:标记离心管,加液体培养基。 3️⃣ 混匀菌液:用枪头...
● 重组子克隆的鉴定: 利用菌落PCR可以直接筛选含有特定外源基因的重组克隆,如绿色荧光蛋白基因(GFP)等。这种方法避开了提取质粒的繁琐过程,提高了实验效率。 ● 测序前PCR扩增: 传统的测序前PCR扩增需要以碱裂解等方法抽提的DNA为模板,而菌落PCR则可以直接以菌体热解后暴露的DNA为模板进行PCR扩增和荧光标记,降低了测...
一、引言常规的PCR扩增需要进行细菌培养、质粒制备等多步操作后才能进行基因扩增,操作繁琐耗时较长,同时在反复的操作中DNA量损失也较大,产率较低。在1989年 Gussow Clackson3建立了菌落PCR( colony PCR)法,菌落PR与我们通常的普通DNA的PCR的不同在于,直接以单个菌作为模板。是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒...
4、将已经接种有菌落的平板置37℃培养箱培养过夜,使菌落扩增;次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板,直接接种摇菌,如果早上做PCR的话,下午就可以提质粒,得到重组载体。 注意事项:设计引物很关键。一般如果是定向克隆,用载体上的通用引物即可;如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆(如单酶切...
PCR仪 电泳仪 琼脂糖凝胶 DNA Marker🔧 实验步骤 📌 配置PCR体系 在多个1.5ml离心管中配好PCR体系,一般多配0.5-1个体系的量,以避免枪尖误差。按照所用酶的说明书配置体系和变形、延伸温度和时长。📌 挑取菌落 在长有菌落的板上挑取单个菌落,先保种于对应抗性的琼脂板或液体培养基中,再混入PCR单管中混...
菌落PCR流程 首先，我们需要准备好PCR预混液。一个典型的PCR体系（20ul）包括：8ul水，1ul引物F，1ul引物R，10ul mix酶，以及从超净台中挑选的菌体。接下来，根据需要挑选的菌落数量来配置相应的体系。例如，如果我们要验证16个菌落，可以预先按照20个菌落的配方进行计算。具体来说，就是加入160ul水，20ul引物...
菌落PCR是一种通过菌落数倍增的方法,用于从混合菌落中特异地扩增目标DNA片段。其原理基于以下步骤: 1.菌落挑取:从含有混合菌落的培养基表面,使用微生物学鉴定方法确定目标菌落,并用无菌的微量砂尖针取一小部分菌落。 2.菌落裂解:将菌落样本转移到一反应管中,并使用裂解缓冲液将菌落细胞裂解释放DNA。裂解缓冲液含有特...
一般来说, 菌落 PCR 能够筛选阳性克隆. 象你的实验中出现的这种假阳性结果, 也不是什么太反常的事情, 细菌本身的基因组也是反应系统中的组分, 所以难免有些假阳性的结果. 建议多用几对不同的引物扩增, 以增加真阳性筛选结果. 一般会出现假阳性,可能是粘在菌落上的目的基因被污染,建议引物一个为目的基因一个为...