④设置参数:选择PCR产物,设计引物对(pairs),更改PCR产物长度,选择自动设计或者手动设计引物,一般选择“automatic”,“Manual”需要更改更多高级参数。若选择手动设计,设置条件约严苛,可供选择的引物对就越少;更改图19,与引物对优化条件(引物设计原则)尽量一致 图18 图19 ⑤选择软件自动设计:可出现许多可供选择的引物...
荧光定量PCR是实验室中出镜率非常高的一种技术手段。它通过在PCR体系中添加荧光基团来显示DNA产物的累积情况,从而达到对PCR过程进行实时监控的目的。并且可以通过数据分析计算出起始模板量,这就是“荧光定量”中“定量”一词的来源。 荧光定量PCR实验因为灵敏度高所以经常是差之毫厘谬以千里,所以在实验过程中,我们需要...
10.引物3′端要避开密码子的第3位。 11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端,且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。 可用oligo 6软件进行比对看结果的情况。 12.做荧光定量产物长度80-150bp最好,最长是300bp. 13.引物设计防止DNA污染,最好跨外显子接头区。 14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70%或...
引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠形成发夹结构，而影响引物与模板的复性结合。上下游引物之间也不能存在互补序列，引物之间互补会产生引物二聚体而降低PCR效率甚至影响定量准确性。如果引物二聚体及发夹结构不可避免，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol...
引物设计原则 1. 长度:引物的理想长度通常在18-25个核苷酸之间,这有助于保证足够的特异性和适当的熔解温度(Tm)。 2. 熔解温度(Tm):引物的Tm应相近,一般在60°C-65°C之间,这有助于实现均匀的退火条件。 3. GC含量:理想的GC含量应在40%-60%之间,避免GC含量过高或过低,以确保引物的特异性和稳定性。
最后简单介绍一下实时荧光定量PCR引物设计原则: (1)引物长度一般在15——30碱基之间,过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 (2)引物GC含量在40%——60%之间,Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度,一般计算公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值。
1. 先选择好探针,然后设计引物使其尽可能的靠近探针。 2. 所选序列应该高度特异,尽量选择具有最小二级结构的扩增片段——这是因为二级结构会影响反应效率,而且还会阻碍酶的扩增。建议先进行二级结构检测,如果不能避免二级结构,那么就要相应提高退火温度。 3. 扩增长度
设计荧光定量PCR引物的一般原则 1. 引物长度为20或21 bp; 2. 避免引物中连续出现5个或以上相同碱基,例如AAAAA或GGGGG; 3. 每条引物两端的碱基最好是G或C(GC碱基之间为三个氢键连接,保证引物与模板连接的稳固性); 4. GC含量为45%~55%; 5. PCR产物大小为85~300 bp; ...
我们先来看一下引物和探针设计的通用原则。 Taqman荧光PCR探针和引物设计指南(PrimerExpress 3.0, ABI) 这个表格基本上把引物探针设计原则都说的很清楚了,只要按照上面的原则一般都能设计出比较好的引物探针。 网上应该可以找到很多关于引物设计的原则和注意事项,然而并没有什么用。引物探针基本上都是软件设计的,比如PP...