构建KI细胞系需要注意的细节 KI细胞系的构建流程是先设计sgRNA及Donor模版,然后通过核糖核蛋白法(Ribonucleoprotein, RNP)或质粒法等方法将sgRNA、Cas蛋白和Donor模板转进细胞中。以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过...
KI细胞系的应用前景其中作为利用报告细胞系来评估药物靶标的一个例子hela细胞系被核蛋白histone1mtagbfp2细胞骨架标记物tubulinmclover3和已知的自噬受体蛋白sqstm1mruby3标记以筛选能诱导细胞质自噬囊泡积累的激酶抑制剂具有已知靶标从而评估自噬囊泡的积累 KI细胞系的应用前景 在细胞系中敲入报告基因是CRISPR/Cas9最...
当用适当化合物处理KI细胞系时,就可以产生反映基因表达特定变化的光信号。 因此,利用报告细胞系的测定可以做到快速筛选大量样品并排除那些具有细胞毒性或不能与细胞相互作用的化合物。其中,作为利用报告细胞系来评估药物靶标的一个例子,HELA细胞系被核蛋白(Histone 1-mtagBFP2),细胞骨架标记物(βtubulin-mClover3),...
KI细胞系可用于药物靶标鉴定和候选评估。一旦选择特定基因作为靶标,设计KI方案,将目的基因与敏感度高的报告基因融合(如萤火虫荧光素酶基因)的细胞模型,产生易于测量的光信号,反映目的基因转录的变化。当用适当化合物处理KI细胞系时,就可以产生反映基因表达特定变化的光信号。 因此,利用报告细胞系的测定可以做到快速筛选...
报告基因KI细胞系的应用前景 自CRISPR/Cas9技术于2012年开发出来,这项基因编辑工具彻底改变了生物学研究,使研究疾病更加容易,研发药物的进程更快。由于其简单的机制,CRISPR/Cas9系统已成为当今世界基因组编辑的同义词。CRISPR系统是一种精确的基因组编辑技术,可通过用所需供体序列替换掉靶基因序列,由此进行基因敲除或敲入...
以RNP法为例,将合成的sgRNA、纯化后的Cas9蛋白和Donor模板电转进目标细胞中,通过抗性筛选、PCR鉴定及测序确定KI细胞系是否构建成功。在这个过程中,sgRNA的设计、Donor模板的设计等均会影响最终的编辑结果,下面我们总结了会影响基因编辑效率的部分原因: 1. sgRNA的设计 sgRNA-Cas9在KI基因编辑系统中如“剪刀”一般精准...
2、构建如下图的Donor载体,之后把Cas9/sgRNA载体和Donor载体(质量比为4μg:8μg)共同转染细胞(本实验使用HEK293细胞,60mm;使用磷酸钙转染),建立KI细胞系。 图4.CRISPR-Cas9介导的靶向基因组插入技术构建细胞系示意图 筛选细胞: 1、转染之后的细胞,分别加G418(针对Neomycin)和GCV(针对PGK TK)药物来筛选细胞(加...
随后在HEK293T细胞中验证供体载体pMDT-LER能成功表达eGFP后,将EAV-HP打靶载体和供体载体共转染至DF-1细胞,观察绿色荧光阳性细胞,提取细胞基因组,PCR检测外源基因eGFP成功整合至鸡基因组EAV-HP位点。最后,将转基因细胞DF-1传至第7代,用PCR和Western blo...
基因敲入细胞系定制服务 相比于基因敲除(ko),在设计基因敲入(ki)的实验方案时需考虑的影响因素更多,如敲入基因片段的长短、同源重组效率等,且不同细胞系之间的基因敲入效率差异很大,这也使得ki的技术难度更高。赛业生物成熟的基因编辑平台,可提供基因敲入细胞株的构建服务,产生高效同源重组。基于cell igeneeditor™...
一、A549肺癌细胞是贴壁上皮细胞,通过人A549肺癌细胞系稳定表达两种可诱导的报道基因,目前DELF生物目前从事该细胞的基因编辑包含了对MAVS、MD a5、RIG-I等基因的敲除,稳定过表达ACE2受体等。A549细胞系是哮喘、过敏和呼吸道感染的良好表征的细胞模型。 二、B16黑色素瘤细胞来源于C57BL/6来源的鼠B16黑色素瘤细胞系,...