ChIP、RIP 和蛋白质核酸 Pull-Down 产品 抗体选择工具 第5 步:解交联与 DNA 净化 与目标蛋白质结合的 DNA 富集是染色质免疫沉淀的目标。DNA 水平可通过琼脂糖凝胶电泳或更常用的定量聚合酶链反应(qPCR)测定。在染色质免疫沉淀实验的特定 DNA 产物被...
作为一种研究蛋白质与DNA相互作用的技术，ChIP可以完整真实地反映细胞中特定蛋白与DNA的结合关系，它通过多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质-DNA提取）、核酸剪切、抗体免疫沉淀、DNA样本回收，将蛋白-DNA复合物分离出来进一步研究特定的结合蛋白或与其结合的DNA，同时结合qPCR（ChIP-qPCR）可用...
ChIP的标志之一是通过qPCR定量纯化的DNA产物的能力。需要以解交联和纯化后2%的Input DNA(不稀释)、目的蛋白抗体IP后的DNA、IgG抗体IP后的DNA分别作为模板(各取未稀释的DNA 2ul),分别加入所要检测的目的基因对应的ChIP引物,进行定量PCR反应,并获得各自的Ct值。按照下面公式计算ChIP富集效率: Percent Input = 2% x ...
在免疫沉淀复合物中的DNA分离提取后,可以通过PCR来进行鉴定。无论是EMSA实验还是ChIP分析,都可以较好地用于分析特定转录因子与相应DNA元件的结合活性,既可以用于定性分析,也可以进行相对定量分析,获得转录因子活化程度的相关信息。 现有的方法主要局限于已知蛋白质及其结合的DNA片段分析,进行DNA芯片或者二代测序鉴定。
ChIP还被用来确定基因组上与组蛋白修饰相关的特定位点（即组蛋白修饰酶的靶标）。 此方法的简要过程是：细胞裂解液里的蛋白和相关染色质暂时结合；染色质(DNA)-蛋白复合物被剪切，与所研究蛋白相关的DNA片断被选择性免疫沉淀；相关DNA片断被纯化，顺序被测定。一般认为这些DNA顺序在活体内与所研究蛋白结合。
染色质免疫沉淀(ChIP)测定 是一种强大的方法,可用于分析与特定调控蛋白结合的表观遗传修饰和基因组 DNA 序列。 染色质免疫沉淀实验需要多种蛋白质组学和分子生物学方法,包括交联、细胞裂解(蛋白质-DNA 提取)、核酸剪...
但有一点需要注意,有些靶蛋白的ChIP实验是不适合采用GAPDH的基因来作为靶蛋白抗体的阳性引物对照的,因为异染色质区域的组蛋白修饰类型(例如H3K9me3或H3K27me3等修饰)不会发生在GAPDH基因上,GAPDH是管家基因,一直高表达,一般不会发生H3K9me3或H3K27me3等抑制基因表达的修饰类型。
染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而...
但有一点需要注意,有些靶蛋白的ChIP实验是不适合采用GAPDH的基因来作为靶蛋白抗体的阳性引物对照的,因为异染色质区域的组蛋白修饰类型(例如H3K9me3或H3K27me3等修饰)不会发生在GAPDH基因上,GAPDH是管家基因,一直高表达,一般不会发生H3K9me3或H3K27me3等抑制基因表达的修饰类型。