2. 明胶酶谱的活性受钙离子,锌离子和pH值等因素的影响,因此缓冲液配制应严格准确,尽量用超纯水,孵育温度要控制好。 3. 为防止样品中的酶变性失活,禁忌煮沸蛋白样品,且上样缓冲液中不能含β-巯基乙醇或DTT。 4. 孵育液的pH最好在7.5——7.6,复性的Triton放置时间过长会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的溶液。 5.
洗涤缓冲液2:将50 mmol/L Tris(pH 7.5),10 mmol/L CaCl2,0.01% Tween 20,5 mmol/L 邻二氮菲混合均匀。 8%分离胶(含0.1%明胶):将30% 丙烯酰胺2.7 ml,ddH20 4.5 ml,1.5 mol/L Tris(pH 8.8)2.5 ml,10% SDS 100 μl,10% 过硫酸铵(APS) 100 μl,TEMED 6 μl混合均匀。 浓缩胶:将ddH20 2.1...
明胶酶谱实验可以检测MMP2和MMP9的活性,是分子生物学的常用实验技术之一。 先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条...
明胶酶谱实验是一种常用的分子生物学实验技术，主要用于检测MMP2和MMP9的活性。以下是明胶酶谱实验的基本步骤：1.样品制备：将待测样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离。2.酶活性恢复：在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性。3.凝胶染色：在各自的迁移位置水解...
明胶酶谱实验 原理 细胞外基质(ECM)是细胞生存的重要内环境,不仅含有胶原、糖蛋白、蛋白多糖等成分,而且含有大量的蛋白酶、细胞因子、黏附分子。ECM,尤其是其中的基底膜,是肿瘤转移过程中必须克服的生理屏障。基质金属蛋白酶家族(MMPs)可以降解细胞外基质,帮助肿瘤细胞克服这一屏障 ...
🔬 实验准备 首先,我们需要收集处于对数生长期的癌细胞培养液。🧪 实验步骤 1️⃣ 将500μl培养液、45μl明胶琼脂糖颗粒(使用前需混匀)和45μl平衡缓冲液混合均匀,然后加入微型旋转柱中,在旋转混合仪上平衡30分钟。2️⃣ 用100μl洗涤缓冲液1洗涤琼脂糖颗粒,每次洗涤3次,每次7000r/min离心以除去洗...
明胶酶谱法实验步骤 (1)、取6孔板中对数生长期的肿瘤细胞,用无血清RPMI1640培养基冲洗3次, 每孔中加入1ml无血清RPMI1640培养基,实验分组,加入干预因素,37o C、5%CO2恒温培养箱中培养24h。 (2)、将细胞培养上清液移入离心管中,4°C、2000rpm离心10min,取上清分装 后–80°C保存备用。 (3)、BCA法测定各样...
1、明胶酶谱法实验步骤:取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。 2、明胶酶谱法实验步骤:次日收集上清液,将上清液移入离心管中 2000rpm 离心10min,-70℃储存备用。 3、明胶酶谱法实验步骤:根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度(或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致)。与5×上样缓冲液混...
8.扫描分析:将胶以ImageScanner(Amersham)扫描成像,ImageQuant TL V2003软件分析各酶谱条带灰度值,比较各组样本MMPs活性的差别。 3、胶原酶谱法检测MMPs的表达及活性胶原溶液配制:称取10mg胶原,溶于0.3M醋酸溶液中,最后定容至10mg/ml,于4°C备用。其余步骤同明胶酶谱法。 4、反向明胶酶谱法检测TIMPs的表达及活...
在分子生物学和生物化学研究领域,明胶酶谱实验是一项常用于检测基质金属蛋白酶(MMPs)活性的关键实验。MMPs是一类在细胞外基质降解中发挥关键作用的蛋白酶,而MMP2和MMP9作为其中的代表性成员,对于细胞迁移、侵袭和组织修复等生理过程至关重要。因此,准确测定MMP2和MMP9的活性对于深入了解细胞内信号传导和疾病发展机制具有...