抑制消减杂交法(SSH)是一种新的以PCR反应为基础的cDNA消减杂交方法。它是通过合成两个不同的接头,连接于经限制性内切酶消化后的cDNA片段的5’端,达到选择性扩增目的cDNA片段,同时抑制非目的cDNA的扩增。 其优点是: 1.可有效分离高、低丰度的差异表达基因。 2.技术方法简单,成熟,易操作。 3.灵敏度高。 4.重复...
一、cDNA第一链的合成 1、在0.5ml经DEPC处理过的离心管中分别加入tester和driver的mtRNA各2ug,然后加入1ul(10uM) 随机引物(9mer),70℃温浴2min,然后迅速置于冰上放置2min,然后在每管中加入如下混合物: 5×First-strand Buffer 2ul dNTPs Mix(10mM) 1ul sterile H2O 1ul AMV Reverse Transcriptase(20U/ul...
抑制消减杂交法分离与鉴定灵芝G蛋白β亚基基因
目的:应用抑制性消减杂交( suppression substractive hybridization,SSH)方法分析、研究结肠癌相关基因。方法:在联合使用全反式维甲酸( all trans retinoic acid A,TRA)和 1,25-二羟维生素 D3[1,25 (OH)2D3]诱导大肠癌细胞株 LoVo细胞分化的基础上,以大肠癌细胞提取的 mRNA为模板合成的 cDNA作为测试子,逆转...
基本流程:通过差减文库构建,文库验证和筛选(逆向斑点杂交),获得阳性克隆,对阳性克隆测序及生物信息分析,可判定差异基因的情况。另外结合RACE技术可进一步克隆所获得的差异基因的cDNA全长序列,并可用Northern blot 或Real-Time PCR加以验证。 抑制性消减杂交文库技术 是一种革命性的差异表达基因筛选技术。该方法结合了抑...
【摘要】目的:应用抑制性消减杂交( suppressiOnsubstractivehybridizatiOn,SSH )方法分析、研究结肠癌相关基 因。方法:在联合使用全反式维甲酸( aIItransretinOicacidA,TRA )和1,25-二羟维生素D3 [1,25( H) 2D3 ]诱导大肠 癌细胞株LOVO细胞分化的基础上,以大肠癌细胞提取的mRNA为模板合成的cDNA作为测试子,逆转...
抑制消减杂交法(SuppressicSubtractiveHybridization,SSH)是最近(1996)报道的能有效鉴别两个不同细胞群差异表达基因的新方法[1,2]。该方法是以抑制PCR和消减杂交法为基础,在一轮反应中实现mRNA的均等化和消减步骤。本文对SSH法的原理、优缺点作了介绍,并与其它检测差异表达基因的方法,如mRNA差别显示法(DDRT-PCR)、...
方法1.应用抑制性消减杂交法(SSH)构建一对来自同一个体复发与初治时 的急性淋巴细胞白血病差异表达基因的eDNA文库,通过斑点杂交及基因测序, 筛选出差异表达的未知基因的EST片段。选择其中一个EST片段,采用电子克隆 结合RT—PCR方法获得未知基因的cDNA全长。半定量RT-PCR检测该基因在正常 人和急性白血病病人中的表达。2...
提取两组大鼠主动脉中膜RNA,反转录成cDNA,采用抑制消减杂交法(SSH)分离钙化组较正常组高表达基因的cDNA片 段,将差异片段与PMD18-T质粒载体连接起来,热转化法转化感受态菌DH-5α,建立钙化组与对照组之间的差异表达cDNA文库.菌落PCR法鉴定重 组载体,测序阳性克隆,BLAST比对分析测序结果.随机对Nell1等6个基因进行...